李漢青，王 芳，何家才

探索能有效抑制過度破骨細胞形成和功能的藥物對于預防和治療炎癥引起的種植體周圍骨吸收至關(guān)重要[1-2]。核因子κB受體活化因子配體 (receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族的成員，來源包括巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞和 T 細胞[3]。RANKL可以通過與破骨前體細胞表面的RANK特異性的結(jié)合，激活下游信號通路，誘導調(diào)節(jié)破骨細胞形成。石斛為蘭科石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱。在石斛屬植物中，鐵皮石斛被認為具有最佳的中藥藥用特性，特別是富含多糖的莖和葉，近來的一些研究[4]表明石斛多糖具有抗癌、抗感染、免疫增強等生物活性。該研究旨在探討鐵皮石斛多糖對 RANKL誘導BMMs向破骨細胞分化的影響，以期為種植體周圍骨吸收的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器MEMα培養(yǎng)基(美國賽默飛公司)；PBS緩沖劑(美國Solarbio公司)； BI胎牛血清(以色列生物工業(yè)公司)；RIPA 裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；重組小鼠RANKL(美國R&D公司)；重組小鼠M-CSF(美國R&D公司)；蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)；PCR引物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；c-Fos鼠單克隆抗體(武漢谷歌生物科技有限公司)； p65兔單克隆抗體(美國ABCAM公司)；NFATc1兔單克隆抗體、phospho-p65(p-p65)兔單克隆抗體、P38兔單克隆抗體、phospho-p38(p-p38)兔單克隆抗體(美國CST公司)；Actin鼠單克隆抗體(北京中杉金橋公司)；山羊抗鼠/兔二抗(北京中杉金橋公司)；牛血清白蛋白(BSA)(德國BioFROXX公司)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)；全自動酶標儀(美國Bio-Red公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)。

1.2 方法

1.2.1BMMs體外分離培養(yǎng) 選取4周齡的SPF級C57BL/6雄性小鼠，使用脫頸法處死， 75%乙醇溶液中消毒，剝除小鼠腿部的皮膚，自股骨頭處將腿部分離，去除肌肉骨骺，保留股骨、脛骨，PBS清洗2遍，注射器吸取含10%FBS的MEMα培養(yǎng)基沖洗骨髓腔沖出骨髓，過70 μm細胞篩，加4倍于骨髓懸液體積的紅細胞裂解液，混勻，作用3 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用MEMα完全培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)24 h，次日收集上清液中未貼壁細胞，用含50 ng/ml 巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)的MEMα完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換液，直至細胞達到目標數(shù)量。

1.2.2鐵皮石斛多糖制備 鐵皮石斛原球莖60 ℃烘干，粉碎，90 ℃水浴，震蕩，室溫靜置30 min， 2 000 r/min離心10 min，收取上清液，加質(zhì)量體積分數(shù)3%三氯乙酸脫蛋白，4 ℃靜置24 h，4 000 r/min 離心15 min，收上清液，加入無水乙醇配制成75%乙醇溶液，4 ℃靜置12 h，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，收集沉淀物，凍干處理，稱重，去離子水充分溶解制成石斛粗多糖溶液，過濾除菌，-80 ℃保存。

1.2.3CCK-8法檢測BMMs增殖能力與細胞活力 收獲BMMs，在96孔板中以1 000/孔的密度鋪板，每組設(shè)置5復孔，待過夜細胞貼壁穩(wěn)定后，對照組添加含有50 ng/ml M-CSF的MEMα完全培養(yǎng)基，實驗組石斛多糖濃度分別為25、50、100、200、400 μg/ml，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，分別在12、24、48、72 h進行CCK-8檢測，吸去上清液，每孔加入100 μl含有10 μl CCK-8試劑的純MEMα培養(yǎng)基，吹去氣泡，37 ℃孵育2 h，通過酶標儀測定450 nm處的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.4Western blot檢測 ① 狀態(tài)良好的BMMs，在6孔板中以1×105個細胞/孔的密度鋪板，陰性對照組添加含有50 ng/ml M-CSF及10% FBS的MEMα培養(yǎng)基，實驗組在此基礎(chǔ)上添加100 ng/ml RANKL以及不同濃度的石斛多糖(0、25、50、100、200 μg/ml)，3 d換液，第5天提取總蛋白。② 在6孔板中以3×105個細胞/孔的密度鋪板，待細胞過夜穩(wěn)定，陰性對照組添加含有50 ng/ml M-CSF及MEMα完全培養(yǎng)基，實驗組用濃度分別為0、25、50、100、200 μg/ml鐵皮石斛多糖預處理2 h，加入100 ng/ml的濃度RANKL，刺激30 min，提取蛋白。使用Brandford法進行蛋白定量，配制SDS-PAGE凝膠，6%和10%分離膠，5%濃縮膠，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，5% BSA封閉45 min，一抗稀釋液稀釋抗體，抗p65(1 ∶800)、抗phospho-p65(1 ∶500)、抗c-Fos(1 ∶500)、抗p38(1 ∶1 000)、抗phospho-p38(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌膜，以1 ∶5 000濃度室溫孵育二抗1 h，曝光顯影。通過Image J進行灰度分析。

1.2.5qRT-PCR檢測 在6孔板中以1×105個細胞/孔的密度鋪板，實驗分組設(shè)置陰性對照組添加含有50 ng/ml M-CSF及10% FBS的MEMα培養(yǎng)基，實驗組在對照組的基礎(chǔ)上添加100 ng/ml RANKL以及不同濃度的石斛多糖，濃度分別為0、25、50、100、200 μg/ml，于1、3、5 d收細胞提取RNA，檢測活化T細胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)、組織蛋白K(cathepsin K,CTSK)、金屬基質(zhì)蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)基因的表達。相關(guān)引物序列見表1，引物由上海生工設(shè)計合成。

1.2.6TRACP染色 收獲BMMs，在24孔板中以1×104/孔的密度鋪板，每組設(shè)置4復孔，待過夜細胞貼壁穩(wěn)定后，實驗分組如下：陰性對照組添加含有50 ng/ml M-CSF及10% FBS的MEMα培養(yǎng)基，實驗組在對照組的基礎(chǔ)上添加100 ng/ml RANKL以及不同濃度的石斛多糖，濃度分別為0、25、200 μg/ml，每3 d全換液，在第7天吸去上清液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，TRACP染色試劑盒實驗步驟進行染色，倒置顯微鏡拍照。

表1 相關(guān)基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 石斛多糖對BMMs細胞增殖活力的影響CCK-8實驗顯示：25～200 μg/ml濃度范圍內(nèi)，細胞增殖活力與對照組(0 μg/ml)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在24、48、72 h，400 μg/ml組細胞增殖受到抑制，OD值顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=202.664，F(xiàn)=103.908，F(xiàn)=38.942，P<0.05)。見圖1。

2.2 Western blot檢測鐵皮石斛多糖對RANKL誘導的BMMs向破骨細胞分化相關(guān)蛋白表達的影響通過不同濃度的石斛多糖作用于RANKL誘導的破骨細胞分化，檢測破骨細胞活化中的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路和p38通路的相關(guān)蛋白，NFATc1，轉(zhuǎn)錄因子c-Fos(transcription factor c-Fos,c-Fos)，p38、p-p38、p65、p-p65，以Actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示鐵皮石斛多糖抑制了c-Fos，NFATc1蛋白的表達(F=106.011，F(xiàn)=119.529，P<0.05)，降低了了p65和p38的磷酸化水平(F=896.024，F(xiàn)=843.935，P<0.05)，而對于p65和p38總蛋白含量無明顯影響(F=8.125,F=0.668,P>0.05)。見圖2。

2.3 石斛多糖對RANKL誘導的BMMs破骨分化相關(guān)基因表達的影響不同濃度的石斛多糖處理BMMs 1、3、5 d后，在RANKL誘導的條件下，通過qRT-PCR法檢測破骨細胞相關(guān)基因的表達。qRT-PCR的檢測結(jié)果顯示：1、3、5 d，CTSK的表達持續(xù)上調(diào)(F=104.894，F(xiàn)=122.260，F(xiàn)=780.135，P<0.05)；1、3、5 d，50、100、200 μg/ml組NFATc1的表達表現(xiàn)出上升趨勢(F=36.736，F(xiàn)=283.965，F(xiàn)=124.576，P<0.05)；TRACP前期表達水平較低，隨著時間其表達量明顯上升(F=399.484，F(xiàn)=5 110.477，F(xiàn)=1 398.642，P<0.05)；MMP9基因表達總體表現(xiàn)出上升(F=284.939，F(xiàn)=114.198，F(xiàn)=255.071，P<0.05)，100 μg/ml及200 μg/ml組MMP9的表達量在5 d時出現(xiàn)下降(F=194.290，F(xiàn)=559.875，P<0.05)；同時間段，石斛多糖組相關(guān)基因表達始終低于0 μg/ml即單純RANKL誘導組，且表現(xiàn)出劑量依賴(P<0.05)，第5天時，0 μg/ml組相對于200 μg/ml組CTSK的表達為：537.23±17.08(F=780.135，P<0.05)，NFATc1的表達為10.11±1.46(F=124.576，P<0.05)，MMP9的表達為911.93±42.45(F=255.071，P<0.05)，TRACP的表達為471.69±6.71(F=13.98.642，P<0.05)。見圖3。

圖1 CCK-8法檢測石斛多糖對BMMs細胞增殖活力的影響

圖2 Western blot檢測破骨細胞蛋白水平的表達

A：Western blot法檢測c-Fos、NFATc1、p-p65、p65、p-p38、p38蛋白的表達；B：Western blot灰度統(tǒng)計分析；1：對照組；2：0 μg/ml組；3：25 μg/ml組；4：50 μg/ml組；5：100 μg/ml組；6：200 μg/ml組；與0 μg/ml組比較：*P<0.05

圖3 qRT-PCR檢測破骨分化相關(guān)基因表達

2.4 破骨細胞TRACP染色結(jié)果顯示：單純RANKL誘導有體積相對較大，包含有超過10個細胞核的破骨細胞形成，高濃度鐵皮石斛多糖組的破骨細胞形成明顯受到抑制，僅形成了少量體積相對較小的不成熟破骨細胞。見圖4。

圖4 破骨細胞TRACP染色 ×100

A: 對照組；B: RANKL+0 μg/ml石斛多糖；C：RANKL+25 μg/ml石斛多糖；D：RANKL+200 μg/ml石斛多糖

3 討論

本研究觀察到石斛多糖在體外抑制RANKL誘導的破骨細胞形成，表明其在治療種植體周圍炎骨吸收的潛力。鑒于先前證實的石斛多糖的免疫調(diào)節(jié)活性[5-6]和抗癌活性[7]，石斛多糖可能也是治療伴隨腫瘤的骨破壞性疾病的候選藥物。 故如能揭示石斛多糖對于破骨細胞作用的分子和細胞機制，對于探索其骨溶解的治療潛力將是非常有價值的。

骨再生和重塑中受控的量的吸收是正常骨生理學的一部分。骨形成與再吸收的平衡是不穩(wěn)定的，諸如慢性炎癥或癌癥中的骨轉(zhuǎn)移等病理情況下，破骨細胞生成因子與破骨細胞抑制因子的比例上調(diào)導致骨的凈吸收發(fā)生。破骨細胞分化由間充質(zhì)細胞通過細胞間接觸和旁分泌作用所支持，其受M-CSF和RANK，RANKL和骨保護素(osteoprotegerin, OPG)信號通路軸的調(diào)控。M-CSF和RANKL對于破骨細胞形成是必需的，M-CSF主要通過上調(diào)Bcl-xL來刺激破骨細胞祖細胞的存活和增殖，而RANKL刺激破骨細胞的分化[8]。本實驗中使用原代培養(yǎng)的C57BL/6小鼠的骨髓單核細胞，通過M-CSF和RANKL進行誘導，相較于使用巨噬細胞系誘導破骨細胞更符合體內(nèi)破骨細胞的來源。RANK屬于TNF超家族受體，最初在T淋巴細胞和成骨細胞中被鑒定，RANKL與RANK的結(jié)合導致受體的三聚化并募集銜接蛋白腫瘤壞死受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)募集。隨后啟動細胞內(nèi)信號的級聯(lián)，包括NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、活化蛋白-1(activator protein 1，AP-1)、NFATc1。在這些信號傳導途徑中，具有共刺激免疫受體的RANKL / RANK / TRAF6軸導致轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATc1的強烈誘導，其在破骨細胞分化中起著不可或缺的作用。c-Fos是AP-1轉(zhuǎn)錄因子復合物的組成部分，參與破骨細胞形成的調(diào)節(jié)。NFATc1作為破骨細胞分化中的主要轉(zhuǎn)錄因子，在RANKL介導的NF-κB、AP-1和MAPK信號傳導途徑的下游發(fā)揮作用[9]。c-Fos信號的傳導可以觸發(fā)NFATc1的自動擴增，這是NFATc1依賴性轉(zhuǎn)錄過程和RANKL誘導的破骨細胞生成所必需的，NFATc1的活化會上調(diào)下游破骨細胞特異性基因的表達，例如CTSK、TRACP、MMP9等[10]。本研究中，石斛多糖顯示出顯著下調(diào)了c-Fos的蛋白質(zhì)水平。且降低NFATc1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，隨后以劑量依賴性的方式降低破骨細胞標記基因CTSK和TRACP的基因表達水平，MMP9為破骨細胞重要的功能酶，本實驗顯示鐵皮石斛多糖同時下調(diào)了MMP9的基因表達水平，表明其鐵皮石斛多糖可能同時會抑制破骨細胞吸收功能。RANKL / RANK也激活NF-κB途徑，NF-κB為調(diào)節(jié)破骨細胞分化重要的轉(zhuǎn)錄因子。 IκB的降解使得NF-κB復合物(包括NF-κBp65/ Rel A)磷酸化易位至細胞核并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。本實驗顯示石斛多糖抑制NF-κB活性，其抑制了p65的磷酸化，而對于總p65含量無明顯影響，故可能影響p65的核遷移，從而降低了后續(xù)相關(guān)基因的表達。p38 MAPK途徑在RANKL介導的破骨細胞分化中起重要作用[12]。本實驗檢測了鐵皮石斛多糖對于P38通路的作用，發(fā)現(xiàn)石斛多糖減弱了p38的磷酸化，而對于總p38蛋白含量無明顯作用。此外，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)[13]、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)[14]等也對于破骨細胞的形成，存活，功能有著重要作用。 對于這些信號通路分子，石斛多糖是否發(fā)揮作用，從而影響破骨細胞的形成，存活和功能，需要后續(xù)實驗進一步研究探索。