張晨晨，蔡澤宇，王 弦，江冬瑞，吳 強(qiáng),3，王 晶

在女性常見(jiàn)腫瘤中卵巢癌的死亡率居高不下[1]，其中卵巢漿液性腫瘤死亡率占卵巢癌死亡率的70%[2]。因早期卵巢癌臨床癥狀不明顯，導(dǎo)致大多數(shù)患者無(wú)法得到較好的治療效果[3]。截至目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于卵巢癌的研究多數(shù)以商品化的細(xì)胞株為材料[4-5]，但相比之下原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞離體時(shí)間短，生物特性更接近體內(nèi)狀態(tài)，對(duì)卵巢癌防治的研究更有參考價(jià)值[6-7]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于人卵巢漿液性腺癌原代細(xì)胞(human ovarian serous adenocarcinoma cells, HOSACs)的培養(yǎng)常用組織貼壁法[8]，但這種原代培養(yǎng)方法周期長(zhǎng)、容易污染且成功率低，限制了其在卵巢癌領(lǐng)域的研究。該試驗(yàn)通過(guò)改良酶的類型選擇和消化時(shí)間，成功建立一種快速高效的HOSACs培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本 收集2018年1月～2019年5月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院卵巢腫瘤減滅術(shù)的新鮮人卵巢漿液性腺癌標(biāo)本25例，所有病例均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。所有患者在手術(shù)前未曾接受過(guò)化療或放療。依據(jù)最新的國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南，患者均為ⅡB～ⅢC期。上述組織標(biāo)本的獲取已由患者家屬同意捐贈(zèng)，并簽署知情同意書(shū)，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)BI公司；透明質(zhì)酸酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞無(wú)血清凍存液購(gòu)于蘇州新賽美公司；青霉素-鏈霉素購(gòu)于上海賽默飛世爾公司；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal grow factor，EGF)購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；CCK-8試劑盒、細(xì)胞角蛋白CK7抗體、DAPI 購(gòu)于上海碧云天科技公司。

1.2 方法

1.2.1試驗(yàn)前準(zhǔn)備 試驗(yàn)前準(zhǔn)備包括：① 組織沖洗液：PBS+青霉素-鏈霉素雙抗溶液；② 組織運(yùn)轉(zhuǎn)液：DMEM培養(yǎng)基+青霉素-鏈霉素雙抗溶液；③ 改良版消化液：0.1 mg/ml透明質(zhì)酸酶+0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA；④ 完全培養(yǎng)基的配制見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)完全培養(yǎng)基的配置

1.2.2組織塊基本處理 取手術(shù)切除的人卵巢漿液性腺癌組織，用無(wú)菌的生理鹽水沖洗,以去除組織上多余的血污；隨后將組織放入含有1%青-鏈霉素溶液的無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基(即組織轉(zhuǎn)運(yùn)液)中浸泡30～60 min；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，用含有高濃度雙抗的PBS溶液(即組織沖洗液)漂洗2～3次，用眼科剪去除組織周圍毛細(xì)血管、脂肪組織以及壞死組織等；將修好后的組織置入25 ml高壓滅菌后的燒杯中，剪碎至1～3 mm3大小的組織塊分成兩等份，隨機(jī)標(biāo)記為改良組與傳統(tǒng)組。

1.2.3改良組的細(xì)胞培養(yǎng) 將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到離心管中，加入與組織塊等體積的改良版酶消化液，吹打混勻后置于37 ℃恒溫箱消化2～3 min；當(dāng)組織出現(xiàn)稍粘稠狀態(tài)時(shí)應(yīng)立即加入為消化液體積2～3倍的20% FBS的完全培養(yǎng)基終止消化；2 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入細(xì)胞體積2～3倍的完全培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞及組織塊；吸取混勻后的組織細(xì)胞混懸液平鋪在培養(yǎng)瓶中，總體積以1～2 ml(25 cm的培養(yǎng)瓶)最合適，隨后放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天換去一半培養(yǎng)基，以后每天根據(jù)培養(yǎng)基顏色及細(xì)胞爬出的具體情況2～3 d換1次液。

1.2.4傳統(tǒng)組的細(xì)胞培養(yǎng) 將剪碎組織塊均勻的平鋪在培養(yǎng)瓶中，放置37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，靜置20～30 min后輕輕地翻轉(zhuǎn)瓶子，瓶底朝上；靜置過(guò)夜10～16 h后緩慢翻轉(zhuǎn)瓶子，并加入少許完全培養(yǎng)基，使組織浸入培養(yǎng)基中，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h；待第3天補(bǔ)充少許培養(yǎng)基；以后每2～3 d換1次液。

1.2.5培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)相差顯微鏡來(lái)觀察48 h和72 h時(shí)間段HOSACs的形態(tài)學(xué)特征。

1.2.6免疫熒光鑒定HOSACs細(xì)胞純度 2種不同提取方法培養(yǎng)出的HOSACs在進(jìn)行首次傳代時(shí)，分別接種至20 mm玻璃底培養(yǎng)皿中，每皿2×105個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛細(xì)胞固定，0.3%的Triton X-100破膜和山羊血清的封閉，以CK7一抗?jié)舛葹? ∶500、4 ℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫后加抗兔的二抗以濃度1 ∶200、37 ℃避光孵育2 h；再經(jīng)DAPI室溫下染細(xì)胞核5 min；用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)CK7陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.2.7CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 HOSACs培養(yǎng)到第2代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化細(xì)胞，置成單細(xì)胞懸液；改良組與傳統(tǒng)組各一組，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞，接種到96孔板中，設(shè)置5個(gè)平行孔；隨后每隔24 h，取出待測(cè)的96孔板中5個(gè)孔，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在加入CCK-8后2 h讀450 nm處的吸光度(optical density, OD)值；連續(xù)觀察7 d，以時(shí)間為X軸，以A450為Y軸分別繪制改良組與傳統(tǒng)組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 2種原代培養(yǎng)方法的成功率原代細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，在運(yùn)輸、取材和操作3個(gè)時(shí)間段內(nèi)都是極易發(fā)生污染的；在25例標(biāo)本中，改良組培養(yǎng)法有2例污染，無(wú)一例生長(zhǎng)停滯。而傳統(tǒng)組培養(yǎng)法有3例污染，10例生長(zhǎng)停滯，1例均為成纖維，11例培養(yǎng)出來(lái)的原代細(xì)胞含有較多的成纖維細(xì)胞并且在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中癌細(xì)胞生長(zhǎng)極其緩慢。

2.2HOSACs的形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1相差顯微鏡觀察 改良組的原代細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)貼壁延伸, 呈類圓形，細(xì)胞成團(tuán)狀生長(zhǎng)，符合卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)特性；而傳統(tǒng)組處理的原代細(xì)胞在48 h后，僅有組織塊的貼壁，極少量細(xì)胞從組織中爬出，見(jiàn)圖1，圖中箭頭所指的陰影部分為組織塊。在繼續(xù)培養(yǎng)至72 h后改良組長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞呈短梭形，類鋪路石樣特征，其間夾雜較少量多角形細(xì)胞以及極少量成纖維細(xì)胞；而傳統(tǒng)組原代細(xì)胞在72 h后僅見(jiàn)少量短梭形細(xì)胞從組織塊中爬出，見(jiàn)圖2。

圖1 人卵巢漿液性腺癌不同提取方法后48 h細(xì)胞形態(tài) ×100

圖2 人卵巢漿液性腺癌不同處理方法后培養(yǎng)72 h的細(xì)胞形態(tài) ×100

圖3 HOSACs形態(tài)及CK7表達(dá) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 ×400

2.2.2HOSACs細(xì)胞純度 培養(yǎng)的原代細(xì)胞經(jīng)CK7免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)CK7陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，同時(shí)記錄DAPI染核細(xì)胞總數(shù)，改良組的原代細(xì)胞算出CK7陽(yáng)性細(xì)胞比率接近100%，說(shuō)明細(xì)胞純度高；傳統(tǒng)組的原代細(xì)胞陽(yáng)性率僅有50%(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.3 CCK-8法測(cè)定HOSACs生長(zhǎng)曲線2種處理方法所獲得的原代細(xì)胞增殖能力通過(guò)OD值可看出均符合腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，見(jiàn)圖4A。在細(xì)胞接種第3與第7天后，可見(jiàn)改良組增殖速度明顯高于傳統(tǒng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4B、C。

3 討論

近年來(lái)，隨著人們對(duì)腫瘤的深入研究，實(shí)體腫瘤的原代細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為腫瘤基礎(chǔ)研究方法的熱點(diǎn)，擁有離體時(shí)間短、與體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)相接近以及能極大限度的保存細(xì)胞內(nèi)的蛋白分子等優(yōu)點(diǎn)[8]。原代細(xì)胞常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法有組織貼壁法和酶消化法，其中組織貼壁法最為常用。組織貼壁法在培養(yǎng)過(guò)程中不易游離出細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)易停滯且易污染。酶消化法常用的有胰酶和膠原酶，其中膠原蛋白酶消化能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)，從組織塊消化到絮狀物出現(xiàn)至少要數(shù)小時(shí)到數(shù)十個(gè)小時(shí)不等，在長(zhǎng)時(shí)間的消化過(guò)程容易增加污染的概率，因此使用較少。胰蛋白酶-EDTA制劑的應(yīng)用范圍最為廣泛，但是高濃度的胰酶由于消化能力過(guò)于強(qiáng)烈，若不能嚴(yán)格控制消化時(shí)間容則易對(duì)細(xì)胞造成損傷。

通過(guò)總結(jié)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)，本研究探索出一種簡(jiǎn)單、高效提取HOSACs的方法。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)研究，證實(shí)了改良組使用0.1 mg/ml透明質(zhì)酸酶+0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA在37 ℃消化2～3 min的培養(yǎng)方法成功率最高。本試驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)有:① 高純度：HOSACs最多的雜細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，但成纖維細(xì)胞對(duì)于胰蛋白酶的敏感性要高于HOSACs，所以在首次消化時(shí)能去除絕大部分的成纖維細(xì)胞，從而提高HOSACs的純度；② 提取細(xì)胞速度快：對(duì)于間質(zhì)較少的卵巢漿液性腺癌軟組織在強(qiáng)大消化能力的胰蛋白酶作用下可以快速消化成單細(xì)胞團(tuán)；加上透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸的能力，降低細(xì)胞間質(zhì)的黏性，加速細(xì)胞分離[8]；因此在兩者的同時(shí)作用下可以快速分離出細(xì)胞[9]；③ 細(xì)胞生長(zhǎng)快速：結(jié)合組織塊貼壁法，保留消化后的粘稠狀組織塊并繼續(xù)培養(yǎng)是試驗(yàn)成功獲取癌細(xì)胞的關(guān)鍵步驟之一。在胰酶刺激后從組織塊中爬出的細(xì)胞數(shù)量與速度都要遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)組織塊法；加上改良組消化液消化后得到的細(xì)胞懸浮液給組織塊提供了一個(gè)類似體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境，更加有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，研究[8]證明，表皮生長(zhǎng)因子有助于細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增殖，因此在培養(yǎng)基中加入EGF(epidermal grow factor ,EGF)，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中是有助于上皮性卵巢癌的生長(zhǎng)。

圖4 HODACs生長(zhǎng)曲線

A：細(xì)胞總生長(zhǎng)曲線；B、C：第3天、第7天2組細(xì)胞OD值；與傳統(tǒng)組比較：**P<0.01

在反復(fù)試驗(yàn)中總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在人卵巢癌原代細(xì)胞培養(yǎng)中還需要注意幾點(diǎn)：① 取材：盡量在癌灶豐富的地方取且一定要注意無(wú)菌；② 消化時(shí)間：合理控制胰酶消化時(shí)間，不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短；③ 消化酶的體積：必須嚴(yán)格根據(jù)剪碎后的組織塊體積來(lái)確定酶的量；④ 首次換液不宜過(guò)早，一般在24 h以后；換液頻率不宜過(guò)高，每2～3 d 一次較為適宜。⑤ 細(xì)胞混懸液與消化組織塊混合鋪板：由于細(xì)胞量大所以細(xì)胞之間更容易相互接觸，這樣在培養(yǎng)初期可以極大的減少細(xì)胞凋亡，很好的保持細(xì)胞的固有特性[6]。⑥ 增強(qiáng)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)能力：高濃度胎牛血清培養(yǎng)。

綜上，由傳統(tǒng)組與改良組原代細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果對(duì)比，得出改良組的提取方法可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高純度、高增殖能力的HOSACs，從而為卵巢癌的深入研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。