劉蒙蒙，姜 浩，樓文暉，宋 超，孫劍勇，吳偉新

近年來胃癌發(fā)病率逐年升高，雖然通過手術(shù)及化療，患者生存期顯著延長，但總體死亡率仍居高不下[1]。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase, PRMT1)在體內(nèi)廣泛存在，發(fā)揮著重要作用，多年來的研究[2]表明PRMT1廣泛參與了細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)以及mRNA剪接等多種細胞生理活動過程。因此，對PRMT1的研究有助于進一步了解細胞生長與增殖調(diào)控和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望尋求腫瘤藥物治療的新靶點。轉(zhuǎn)錄組是連接生物功能與基因組遺傳信息的橋梁，在探索疾病的發(fā)生發(fā)展及基因調(diào)控等方面發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)通過高通量測序?qū)ξ赴┙M織標(biāo)本與癌旁組織的差異表達譜進行京都基因與基因組百科全書富集分析(kyoto encyclopedia ofgenes and genomes, KEGG)，探討胃癌中PRMT1影響代謝通路的基因表達情況，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)層面為胃癌診治尋找新線索。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及主要試劑

1.1.1病例資料 選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院2018年9月胃癌患者術(shù)后新鮮胃癌組織標(biāo)本2例及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本2例，正常對照來自手術(shù)邊界5 cm以上，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實。其中男1例，60歲；女1例，72歲。其病理均為胃中-低分化腺癌。患者術(shù)前無放化療及靶向等腫瘤相關(guān)治療，無高血壓、糖尿病等合并癥。并選取2018年1～9月間在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院普外科行胃癌根治手術(shù)患者的組織蠟塊。共入組25例，其中男15例，女10例，年齡64～82(64±9.385)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)診斷明確為胃腺癌；②術(shù)前無腫瘤相關(guān)治療。所有患者簽署知情同意書。該實驗經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器 胃癌組織標(biāo)本總RNA提取試劑TRIzol?Reagen、定量試劑TBS380 Picogreen、mRNA分離儀器磁力架、Superscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；建庫試劑TruseqTM RNA sample prep Kit、橋式擴增試劑簇生成試劑盒cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS購自美國Illumina公司；RNA質(zhì)控儀器安捷倫2100生物分析儀購自美國Agilent 公司；NanoPhotometre分光光度計購自德國Implen公司；Oligo d (T)25磁珠購自美國NEB公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Nanodrop公司；RNA保存于-80℃超低溫冰箱DW86L262，購自青島海爾集團。

1.2 方法

1.2.1cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)檢 ① 從胃癌組織標(biāo)本中提取總RNA，按照TRIzol試劑說明書操作，隨后質(zhì)控；檢測所提RNA完整性及濃度和純度，并利用Agilent 2100測定RIN值；② 利用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，在NEB Next碎片緩沖區(qū)隨機打斷mRNA；③ mRNA片段為模板合成cDNA第一條鏈，降解RNA鏈，隨后以dNTPs為原料合成cDNA第2條鏈；④ 篩選150～200 bp的cDNA片段，PCR擴增并純化；⑤ 最后對文庫進行初步定量，并檢測插入片段大小，準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度(大于2×109mol/L)。

1.2.2上機測序及數(shù)據(jù)分析 橋式PCR擴增利用cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS簇生成試劑盒v3-cBot-HS生成clusters，利用Hiseq Xten平臺行雙端150 bp測序。為避免影響后續(xù)組裝的質(zhì)量及生物信息分析的準(zhǔn)確性，檢查鳥嘌呤和胞嘧啶含量分布及原始測序數(shù)據(jù)測序錯誤率并對原始數(shù)據(jù)進行過濾，獲得后續(xù)待分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用STAR(v2.5.lb)軟件對其進行比對分析，RSEM(vl.2.28)進行轉(zhuǎn)錄本水平的定量分析。采用edge R(v3.12.1)軟件進行表達差異顯著性分析，clusterProfiler(v3.0.5)軟件對差異基因集行KEGG通路富集分析。

1.2.3免疫組化 25例胃癌組織標(biāo)本常規(guī)甲醛固定及石蠟包埋，將蠟塊切成5 μm厚的組織切片，覆蓋于預(yù)先經(jīng)過防脫處理的載玻片上，經(jīng)過烤片、水化、抗原修復(fù)，分別滴加一抗PRMT1(1 ∶300)、AKT(1 ∶200)，二抗：HRP-conjugated IgG(1 ∶500)，DAB顯色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡拍照。每個標(biāo)本選5個40×的視野，評出染色深度：無或弱染色為1分，中陽染色為2分，強陽為3分；陽性面積：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。將上述2項分值相乘取平均，得到1～12分的總分區(qū)間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，采用進行統(tǒng)計描述，組間差異采用單因素方差分析進行比較，如方差分析結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則進一步采用t檢驗進行組間差異的兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及RNA-seq數(shù)據(jù)處理TRIzol法提取的胃癌和癌旁組織總RNA的各項質(zhì)量指標(biāo)均達標(biāo)，分離mRNA并成功合成cDNA文庫，質(zhì)檢合格并測序。4個樣本進行過濾和比對分析的待分析數(shù)據(jù)均占相應(yīng)原始數(shù)據(jù)的90 %以上。然后對RNA-seq測序數(shù)據(jù)進行比對分析、基因水平定量及標(biāo)準(zhǔn)化處理。2組的唯一比對率77.4%～88.9%、91.5%～97.3%的reads可以比對到人類參考基因組上。見表1。

表1 測序數(shù)據(jù)比對人參考基因組比對率

2.2 差異表達分析利用edge R軟件篩選差異基因，q<0.05作為基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。2組取交集共獲得758個長度大于200 bp的差異表達基因,與正常胃黏膜組織相比,胃癌中表達下調(diào)基因251個,包括PRMT1；表達上調(diào)基507個。通過 heatmap 軟件包對2組差異表達基因進行聚類分析并得到熱圖，表明了胃癌樣本組織中和正常組織間有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達基因的分布情況。見圖1。

圖1 胃癌樣本組織中和正常組織間有差異基因熱圖綠色：下調(diào)基因；紅色：上調(diào)基因

2.3 KEGG分析本次KEGG富集分析利用KOBAS，并通過Fisher精確檢驗計算。采用BH(FDR)方法多重檢驗控制假陽性率，校正的P<0.05，滿足此條件的定義為在差異表達基因中顯著富集的KEGG通路。見圖2。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)25條顯著富集代謝通路，由于腫瘤的異質(zhì)性，將富集通路中基因數(shù)最多的10條代謝通路進行列表。見表2。

2.4 PRMT1對PI3K-AKT通路關(guān)鍵基因表達相關(guān)性分析在PI3K-AKT信號通路中共有19個基因顯著富集。見表2。利用cBioportal數(shù)據(jù)庫將PRMT1分別對PI3K-AKT信號通路中該19個基因進行相關(guān)性分析，分析顯示PRMT1與PI3K-AKT信號通路上的PPP2R3A[P=2.070×10-14(Spearman),P=1.590×10-14(Pearson)]和THBS4[P=3.257×10-4(Spearman)，P=2.882×10-3(Pearson)]基因負相關(guān)，說明PRMT1可能影響PI3K-AKT信號通路。見圖3。

表2 胃癌和正常組織差異表達基因的KEGG顯著富集通路(P<0. 05)

圖2 KEGG通路富集結(jié)果

1:Amoebiasis;2:Legionellosis;3:Cytokine-cytokine recept…;4:Salmonella infection;5:NOD-like receptor signaling path way;6:Phagosome;7:Malaria;8:Toll-like receptor signaling pathway;9:Tuberculosis;10:Rheumatoid arthritis;11:Leish maniasis;12:Staphylococcus aureus infection;13:Folate biosynthes;14:Osteoclast differentiation;15:NF-kappa B signaling pathway;16:Renin-angiotensin system;17:Transcriptional misr egulation…;18:Chagas disease (Americ…;19:Platelet actiovation;20:cGMP-PKG signaling pathway;21:PI3K-Akt signaling pathway;22:ECM-receptor interaction;23:Basal cell carcinoma;24:Chemliine signaling pathway;25:Pertussis

圖3 胃癌樣本中PRMT1基因與PPP2R3A、THBS4表達相關(guān)性分析

2.5 胃癌組織中PRMT1與AKT蛋白為了進一步驗證PRMT1影響PI3K-AKT信號通路的活性，課題組選取臨床25例胃癌組織標(biāo)本，分別利用PRMT1抗體和P-AKT(473Ser)抗體進行免疫組化染色并打分進行分析，發(fā)現(xiàn)在下調(diào)的PRMT1胃癌組織中AKT 473絲氨酸磷酸化蛋白水平上調(diào)(P<0.001)，說明PRMT1的表達與AKT的活性負相關(guān)，暗示了PRMT1可能抑制PI3K-AKT信號。見圖4。

圖4 免疫組化染色及相關(guān)性分析 ×10

3 討論

PRMT1在PRMT家族最主要成員中，活性最高，占總催化活性的一半以上。PRMTs催化將s-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methionine, SAM) 甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸胍基氮原子上，形成對稱或不對稱的甲基精氨酸[3]。PRMT1屬于Ⅰ型PRMTs，哺乳動物中，PRMT1是主要的精氨酸不對稱二甲基化酶，占不對稱二甲基化酶的90%以上，可以識別多肽RGG/RG序列[4]。在結(jié)構(gòu)上，PRMT1的同源二聚體上含有1個中間腔和2個相對應(yīng)的活性位點。PRMT1是第1個被克隆的真核PRMT，并且已有證據(jù)[5]表明其與p300/CREB結(jié)合蛋白、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶以及PRMT4/CARM1可以一起充當(dāng)核受體，作為介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄激活的共激活劑。多年來的研究[6]表明PRMT1廣泛參與了細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)以及mRNA剪接等多種細胞生理活動過程。該研究顯示PRMT1基因在胃癌組織中下調(diào)，這與以前的研究結(jié)果相吻合[7]。

PI3K-AKT信號通路作為惡性腫瘤細胞存活的關(guān)鍵調(diào)控因子，已成為人們關(guān)注的焦點，許多Akt信號通路抑制劑被發(fā)現(xiàn)具有多種功能和特異性。然而，目前對于該信號通路的調(diào)控及其在腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制尚不明確。課題組利用KEGG對鳥嘌呤和胞嘧啶差異表達基因行富集分析，分析表明顯著富集的PI3K/AKT代謝通路中15個基因顯著上調(diào)。為分析PRMT1是否對PI3K/AKT代謝通路活化起作用，進一步利用cBioportal數(shù)據(jù)庫相關(guān)性分析，PRMT1與其中2個基因 (PPP2R3A、THBS4) 緊密相關(guān)。

蛋白磷酸酶2A調(diào)節(jié)亞基B(“protein phosphatase 2 regulatory subunit B” alpha，PPP2R3A)從屬B"/PR72家族，為PP2A的調(diào)節(jié)亞基，有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)PPP2R3A可受DNA 甲基化而失活，其C-端甲基化可促進核心酶結(jié)合B亞基。PPP2R3A可作為PP2A的調(diào)節(jié)亞基可促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，具有潛在的促細胞轉(zhuǎn)移作用。有研究[9]指出PP2A抑制劑LB100可以通過作用Thr308和Ser473位點抑制AKT的磷酸化從而抑制腫瘤增值。然而有趣的是，在一些特定的腫瘤中，PP2A抑制劑也能促進AKT的磷酸化[10]。但其在胃癌中的作用及機制尚未見報道，本研究從mRNA水平發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中PPP3R2A顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)提示，PPP3R2A可能是胃癌治療的潛在靶點。

THBS4基因是凝血酶敏感蛋白家族(thrombospondins，THBS)新成員，其結(jié)構(gòu)各有一個氨基端和一個羧基端。參與調(diào)節(jié)細胞間接觸、黏附、游走、增殖及血小板聚集。在腫瘤中的研究較少，有的學(xué)者[11]指出THBS4在結(jié)直腸癌中表達減低，可能與其基因甲基化相關(guān)。而THBS4在肝癌中普遍高表達，是預(yù)后不良的獨立危險因素。Liu et al[12]發(fā)現(xiàn)下調(diào)THBS4前列腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著下降。Chen et al[13]證實在胃癌組織中THBS4蛋白高表達，促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移。課題組從mRNA水平的研究結(jié)果與之一致，本研究顯示THBS4在胃癌PI3K/AKT代謝通路中富集明顯，但具體機制尚不明確，其具體的調(diào)控途徑還需要進一步的實驗的驗證。

為了進一步驗證PRMT1影響PI3K-AKT信號通路的表達，選取臨床25例胃癌組織標(biāo)本，分別利用PRMT1抗體和P-AKT(473Ser)抗體進行免疫組化并打分進行分析，發(fā)現(xiàn)在下調(diào)的PRMT1胃癌組織中AKT 473絲氨酸磷酸化蛋白水平上調(diào)(P<0.001)，說明了PRMT1蛋白影響了AKT蛋白的磷酸化，暗示了PRMT1可能抑制PI3K-AKT信號，這與KEGG分析結(jié)果吻合。