常棟，顧建國，賈方方 ，馬文輝，許躍奇，閆海濤

1 河南省煙草公司平頂山市公司，河南省平頂山市建設(shè)路263號，467000；2 商丘師范學院生物與食品學院，植物與微生物互作河南省高校重點實驗室，河南省商丘市文化路293號，476000

煙草黑脛病是由煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）引起的一種重要的土傳病害，該病在高溫、高濕環(huán)境下易流行爆發(fā)，典型癥狀為植株矮化、葉片自下而上凋萎發(fā)黃、根部和莖部萎縮、壞死[1-2]，莖髓部呈碟片狀。近年來，隨著我國煙區(qū)連作煙田比例的增加[3]，煙草黑脛病愈演愈烈，病害嚴重的地塊發(fā)病率高達75%，甚至絕收，給我國煙葉生產(chǎn)帶來重大威脅。生產(chǎn)上多采用種植抗病品種[4-5]和通過化學藥劑[6-7]進行黑脛病的防治，但是當前尚未發(fā)現(xiàn)對煙草黑脛病免疫種，且品種抗性會隨著黑脛病菌生理小種的消長而減低[8]；同時，化學農(nóng)藥易造成環(huán)境污染及煙葉中農(nóng)藥殘留，長期使用還會使病菌產(chǎn)生抗藥性[9]。因此，尋找一種安全、高效、無公害的煙草黑脛病防治方法已成為煙草生產(chǎn)的當務(wù)之急。

生物防治可修復和改良作物的微生態(tài)環(huán)境、抑制植物病害病原菌的生長并激活作物的防御反應，已成為目前國際上病害防治的首選[10-11]。Luna等[12]從香蕉幼苗中分離到了粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcascens），可提高香蕉植株的防御酶活性 ，進而抑制香蕉幼苗的枯萎病。Larran 等[13]從小麥中分離的內(nèi)生菌株鉤狀木霉 （Trichoderma hamatum）、青霉屬（Penicillium sp.）、芽孢桿菌屬和淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）等對小麥黃斑葉枯病具有明顯的防治效果。這些研究均為從病害作物的抗病株中分離拮抗菌，除此之外，從其他非寄主植物中尋找生防菌，擴大內(nèi)生菌的獲得范圍，也逐漸成為生物防治的重要途徑。Prado 等[14]分離出的植物內(nèi)生真菌木質(zhì)素降解子囊菌（Paraconiothyrium variabile）對病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的生長可起到明顯的拮抗作用，并抑制其致病毒素的產(chǎn)生。Romeralo 等[15]從地中海松中分離的內(nèi)生真菌木霉屬（Trichoderma spp.）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans） 等均可對枯梢病病斑的擴展起到有效抑制作用。王蘭英等[16]從砂仁（Amomum villosum Lour.）中分離得到的內(nèi)生細菌SRJ-4 菌株，對水稻紋枯病的盆栽和田間防效分別可達80.7%、79.4%。余杰穎等[17]從石斛（Dendrobium nobile Lindl）中分離的內(nèi)生菌DEB-2 可防治辣椒白星病。上述研究從非寄主作物中分離內(nèi)生菌，皆取得了較好的防治效果，為進一步的生防菌劑復配研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。然而，當前煙草黑脛病的生防菌獲取對象仍然局限于煙草[18-22]，鮮見從其他不同植物中分離篩選拮抗菌，限制了生防菌株的來源及后期菌劑的研發(fā)推廣。本研究從構(gòu)樹、枸杞、馬鈴薯、辣椒、曼陀羅、茄、夾竹桃、煙草等8 種不同植物莖內(nèi)，篩選煙草黑脛病的拮抗菌株，旨在擴大煙草黑脛病微生物防治菌的菌種來源，為研制開發(fā)煙草黑脛病生防菌劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 煙草疫霉菌的分離鑒定

從平頂山市郟縣煙草種植地黑脛病發(fā)病嚴重地塊選取具備煙草黑脛病典型癥狀的植株（中煙100），經(jīng)流水沖洗30 min，切開莖，取片狀髓部，置于胡蘿卜固體培養(yǎng)基于28℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌絲后連續(xù)轉(zhuǎn)移3～4 次純化。通過分離和純化，獲得煙草黑脛病病原菌菌株，觀察其菌落、菌絲、孢子囊形態(tài)，并進行致病性的分析測定。培養(yǎng)基培養(yǎng)的煙草黑脛病菌CTAB 法提取基因組DNA，利用通用引物ITS1、ITS4 進行擴增，產(chǎn)物連接到克隆載體，送至南京金斯瑞生物有限公司進行測序。測序得到的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST 搜 索比對，MEGA6.0 軟件進行Neighbor-Joining 分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株為煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）。

1.2 不同植物內(nèi)生菌的分離與純化

采集構(gòu)樹、枸杞、馬鈴薯、辣椒、曼陀羅、茄、夾竹桃、煙草（發(fā)病地區(qū)健康煙株）的莖桿樣品，按照如下方法進行植物內(nèi)生細菌的分離：

將待分離植物置于流水下沖洗30 min 后切段，用75%的乙醇、2%次氯酸鈉消毒、無菌水沖洗5 次后再用滅菌濾紙吸干表面水分，最后用無菌刀切成2～3×3～5 mm 小段，置于裝有滅菌水的三角瓶中，編號。震蕩三角瓶，用吸管分別吸1 mL 菌液，涂抹于培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)1～3 d，挑取不同形狀的菌落重新置于新的平板上劃線純化。挑取劃線培養(yǎng)的單個菌落移入試管斜面保存，備用。

1.3 拮抗菌的篩選、鑒定

采用平板對峙培養(yǎng)法篩選2 次，將分離出的內(nèi)生菌和煙草疫霉菌接種到胡蘿卜平板培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)3 d。用半徑5 mm 的打孔器將煙草疫霉菌接種到培養(yǎng)基的中心，在菌塊離中心15 mm 處對稱兩側(cè)接種3 μL 拮抗菌液（約1.0×106cfu/mL），倒置，觀察黑脛病菌周圍有無抑菌帶，并測量其抑菌直徑和抑菌率，每處理重復3 次。選取平板對峙效果較好的拮抗菌按上述方法進行第2 次室內(nèi)拮抗實驗。

抑菌率（%）＝［（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑－菌餅直徑）］×100%

抑菌直徑（mm）=對照組病原菌菌落直徑－處理組病原菌菌落直徑

菌株鑒定：綜合室內(nèi)平板對峙實驗與盆栽防效結(jié)果，對拮抗和防病效果較好的拮抗菌，通過形態(tài)觀察[23]、生理生化測試[24-25]和16S rDNA 序列分析[26]對菌株進行種屬鑒定，測序過程和公司同煙草疫霉菌。

1.4 拮抗菌株對盆栽和田間煙草黑脛病的防治效果測定

從篩選出的拮抗細菌菌株斜面上挑取1 環(huán)培養(yǎng)物接種于50 mL NA 液體培養(yǎng)基中，于35℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)12 h 得到拮抗菌種子液。

選擇抑菌活性均達顯著水平的6 個菌株進行溫室盆栽試驗，對照組CK 為只接種病原菌處理：在煙苗還苗后，用手術(shù)刀劃傷煙株莖基部，然后，采用灌根法接種10 mL 煙草黑脛病病原菌；處理1 到處理6 分別為J11、J21、T3、T23、G3 和KY 不同拮抗菌組，于煙苗還苗后，先采用灌根法接種拮抗菌發(fā)酵液（孢子濃度為1.0×108cfu/mL），每盆接種10 mL，7 d 后接種煙草黑脛病病原菌10 mL，此后每7 d 接種拮抗菌發(fā)酵液1 次，發(fā)酵液共接種3 次。每處理9 株，各處理重復3 次，接種14 d 后開始調(diào)查發(fā)病情況。

大田試驗在平頂山市白龍廟村黑脛病高發(fā)地塊進行，于2019 年4 月26 日移栽，將拮抗菌發(fā)酵液稀釋20 倍，每株灌根200 mL，保證其孢子總量同盆栽試驗一致，考慮到大田煙株生育期比盆栽長，將大田接種時間間隔定為15 d，共灌根3 次。每處理63 株，共重復3 次。以自然條件下未作處理煙株為對照。煙草黑脛病分級標準參照中華人民共和國煙草行業(yè)標準（GB/T 23222—2008）進行。

發(fā)病率 =（染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

病情指數(shù) =∑（各級病株數(shù)×該病級值）/ （調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100%

相對防效 =（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.5 拮抗菌培養(yǎng)液灌根對煙株生長的影響

于成熟期，分別從對照組和各處理組（處理1 至處理6）中隨機選擇3 株，測量其株高、莖圍、有效葉片數(shù)、最大葉葉長、葉寬和葉面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物源內(nèi)生菌的分離與平板對峙作用

從構(gòu)樹、枸杞、馬鈴薯、辣椒、曼陀羅、茄子、夾竹桃、煙草等8 種不同植物莖內(nèi)共分離出89 種內(nèi)生菌，室內(nèi)平板對峙拮抗篩出10 種有較好的拮抗作用的內(nèi)生菌。從10 株菌株中篩選出6 株具有較強拮抗作用的內(nèi)生菌（表1），分別為來自構(gòu)樹的J11、J21、G3，馬鈴薯的T3、T23，及煙草中的KY。平板拮抗試驗下該6 株拮抗菌株的抑菌帶清晰透明，寬度均達到5 mm 以上，對病原菌的擴展具有明顯的抑制作用。以T3、KY 和J21 的抑菌效果最好，其抑菌直徑均達到48 mm，抑菌率均高于91%。

表1 拮抗菌對煙草疫霉菌生長的抑制效果Tab. 1 The inhibition effect on growth of Phytophthora parasitica var.nicotianae by antagonistic bacteria

2.2 不同植物內(nèi)生拮抗菌的形態(tài)觀察與理化測試

拮抗細菌形態(tài)觀察和生理生化反應結(jié)果見表2、表3。

表2 拮抗細菌的形態(tài)觀察Tab. 2 Morphological observation of antagonistic bacteria

表3 不同拮抗細菌的生理生化反應Tab. 3 Physiological and biochemical reactions of different antagonistic bacteria

2.3 盆栽和大田防效測定

表4 不同處理盆栽及大田試驗防治效果Tab. 4 Control effect of different treatments in pot and field tests

圖1 不同拮抗菌處理的盆栽防效(a)和成熟期大田防效(b)Fig. 1 Control effect of different antibacterial treatments in pot test (a) and field test (b)

盆栽試驗在接種煙草疫霉菌兩周后，各處理均不同程度地呈現(xiàn)煙草黑脛病的典型癥狀，于成熟期統(tǒng)計各處理最終的發(fā)病情況。其中對照發(fā)病率為100%，同對照相比，各拮抗菌處理的發(fā)病率和病情指數(shù)均得到明顯控制，其中以KY 的病情指數(shù)最低，相對防效最高，達到75.41%。J11、T23 次之（表4，圖1a）。

大田試驗于成熟期各處理開始呈現(xiàn)自然發(fā)病癥狀，由于所選試驗田為往年黑脛病高發(fā)區(qū)，觀其對照，發(fā)病率高達63.68%，極大降低了煙草的產(chǎn)量。采用灌根法接種不同拮抗菌發(fā)酵液后，病情得到了明顯控制，發(fā)病率和病情指數(shù)顯著降低，防治效果明顯，相對防效仍以KY 最高，達到63.62%，J11 和T23 次之，分別為52.67%和51.11%（表4，圖1b）。

2.4 不同菌株對煙株農(nóng)藝性狀的影響

為了解各拮抗菌對煙株農(nóng)藝性狀的影響，進一步調(diào)查了不同菌劑處理下煙株的農(nóng)藝性狀指標（表5）：同對照相比，各處理的株高、莖圍均有顯著性提高，株高以KY 最大，莖圍以J11 最大；而有效葉片數(shù)、葉長、葉寬和葉面積四項指標各處理間差異均不顯著。初步表明各拮抗菌株可通過抑制黑脛病病害的發(fā)生，進而影響煙株株高、莖圍等的生長發(fā)育。

表5 不同拮抗菌劑處理對大田煙株農(nóng)藝性狀的影響Tab. 5 Effects of different antagonistic agents on agronomic characters of tobacco plants in field

2.5 煙草疫霉菌拮抗細菌的16S rDNA 鑒定

圖2 16SrDNA 全序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The full sequence phylogenetic tree of 16 S rDNA

KY、T23、J21 的16SrDNA 序 列 長 度 為 1388bp，1385 bp 和1397 bp，J11 菌 株、G3 菌 株 和T3 菌株的16SrDNA 序列長度均為1400bp。將這6種菌株的16SrDNA 序列用blast 在數(shù)據(jù)庫進行比對，然后用MEAG7 建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特性和16SrDNA 序列同源性分析，KY 初步鑒定為亞麻假單胞菌，登錄號為KM-349418；J11 菌株、G3 菌株和T3 菌株初步鑒定為蠟狀芽孢桿菌，登錄號為MK-675099；T23 初步鑒定該菌為短小芽孢桿菌，登錄號為MG-719573；J21 初鑒定該菌為枯草芽孢桿菌，登錄號為MK-680816。

3 結(jié)論與討論

3.1 內(nèi)生菌的分離、篩選與鑒定

以構(gòu)樹、枸杞、馬鈴薯、辣椒、曼陀羅、茄子、夾竹桃、煙草等8 種植物的莖為分離材料，獲得煙草疫酶菌的拮抗菌株89 株，其中拮抗作用較好的為10種，通過室內(nèi)二次平板對峙篩選出6 株：KY、T23、J11、J21、G3 和T3，經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S rDNA 序列分析，初步鑒定J11、G3、T3 同為芽孢桿菌屬的臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），J21為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），T23 為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；KY 為假單胞菌屬的亞麻假單胞菌（Pseudomonas lini）。經(jīng)過盆栽試驗和大田試驗復篩后，以從煙草中分離的KY（亞麻假單胞菌，Pseudomonas lini）、從馬鈴薯中分離的T23（短小芽孢桿，Bacillus pumilus）和從構(gòu)樹中分離的J11（臘狀芽孢桿菌，Bacillus cereus）防效最好。

本試驗經(jīng)二次平板對峙篩選出的6 株拮抗菌中，除KY 為從煙草中分離的內(nèi)生菌外，其余5 株均為從其他植物中分離篩選，且拮抗效果較好，表明從非寄主植物中亦可獲取對煙草黑脛病防效顯著的生防細菌，該結(jié)論擴展了前人將煙草或其根際土壤作為防治煙草病害生防菌篩選的單一來源的試驗方法[27]。此外，本文從煙草中分離篩選出的亞麻假單胞菌（Pseudomonas lini）在煙草黑脛病的生物防治研究尚未見報道。

試驗篩選出的J11、G3、T3 菌株，雖然同為臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）的，其抑菌率、盆栽和大田防效均不穩(wěn)定，造成這種差異的主要原因是分離純化內(nèi)生菌時選用的不同植物來源；另外，該試驗工作量大，共持續(xù)進行了兩年，內(nèi)生菌的分離及篩選歷經(jīng)了不同的試驗操作人員試驗批次，也會對試驗結(jié)果有一定的影響，下一步亟需建立一套高質(zhì)高效的拮抗菌篩選體系。

3.2 煙草根莖類病害生防菌劑的研發(fā)

本文針對煙草黑脛病開展了生防菌的篩選鑒定，獲得的6 株拮抗菌分別為芽孢桿菌屬[28]和假單胞菌屬[29]，是自然界廣泛分布的生防細菌，種群龐大，對煙草疫霉菌的拮抗作用較強[30]，是煙草黑脛病生物防治中的研究熱點。本文結(jié)果為煙草黑脛病生物防治試驗的第一階段，篩選出的生防菌株正在投入進行：培養(yǎng)溫度、pH 等發(fā)酵條件的優(yōu)化；各菌株對種子萌發(fā)的影響，在煙株體內(nèi)的定殖試驗；以及無互斥作用的2株或2 株以上的菌株之間的復配等第二階段試驗。然后將以大田試驗效果確定拮抗菌劑的濃度、劑型、噴施方式及時間等，最終實現(xiàn)煙草黑脛病的生防菌劑的產(chǎn)業(yè)化，以期為煙草農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供實踐支持。

本研究用煙草疫霉菌為單一篩選目標，然而實際生產(chǎn)中煙草黑脛病、根腐病和根際線蟲病等根莖類病害常相伴發(fā)生，互相影響。若是只針對其中一種病害，易造成生防菌劑防效單一，綜合防病能力差等問題，今后可針對煙草根莖類病害開展內(nèi)生菌的綜合篩選，探明其各自病原菌致病機理，利用我國豐富的生防菌資源，開發(fā)出高效、低毒、環(huán)保的煙草根莖類病害綜合防治抗菌藥物。