何聰蓮 ，鄭志云，陳頤，趙高坤，何承剛，胡彬彬，姜永雷，鄒聰明

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南省昆明市五華區(qū)圓通街33號(hào) 650031；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省昆明市盤(pán)龍區(qū)灃源路452號(hào) 650201；3 云南省煙草公司玉溪市公司，云南省玉溪市紅塔區(qū)鳳凰路120-1號(hào) 653100

煙草（Nicotiana tobacum L.）是重要的經(jīng)濟(jì)作物。蛋白質(zhì)是植物生理功能的執(zhí)行者和生命活動(dòng)的直接體現(xiàn)者[1]。在煙葉成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)含量不斷發(fā)生變化，煙葉成熟度不同，蛋白含量差異較大[2]。隨著蛋白質(zhì)含量的變化，其調(diào)控的能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化也隨之發(fā)生改變[3]。而煙葉品質(zhì)與煙葉體內(nèi)物質(zhì)代謝密不可分，因此，深度探索煙葉衰老過(guò)程中物質(zhì)代謝過(guò)程是提高卷煙品質(zhì)的關(guān)鍵[4]。打頂抹杈改變了煙草植株內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和積累的同時(shí)，也改變了煙葉的正常衰老模式[5]，對(duì)煙葉的成熟度具有重要影響，因此，研究煙葉衰老過(guò)程蛋白質(zhì)變化，可在蛋白質(zhì)組學(xué)層面為煙葉衰老機(jī)理研究提供理論依據(jù)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的廣泛應(yīng)用，已有大量關(guān)于擬南芥、水稻、油菜、棉花等作物的抗脅迫及衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)組學(xué)研究。唐秀英等[6]采用iTRAQ 技術(shù)研究鄉(xiāng)野生稻根系響應(yīng)低溫脅迫蛋白質(zhì)表達(dá)情況及功能，共鑒定到146 個(gè)的差異表達(dá)蛋白，且這些差異蛋白質(zhì)參與信號(hào)傳導(dǎo)和逆境脅迫等代謝過(guò)程。侯曉夢(mèng)等[7]通過(guò)比較棉花化學(xué)打頂和人工打頂?shù)鞍踪|(zhì)組學(xué)研究，共檢測(cè)到69 個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中下調(diào)蛋白參與碳水化合物和能量代謝等過(guò)程，而上調(diào)蛋白參與赤霉素（GA）調(diào)節(jié)，增強(qiáng)GA效應(yīng)。目前，煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中于煙草抗脅迫、抗病蟲(chóng)害、不同肥力梯度下以及品種間、種植區(qū)域間煙葉蛋白質(zhì)組學(xué)研究[8]，而關(guān)于煙葉衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)組學(xué)研究甚少。本研究以煙草品種K326 為材料，結(jié)合iTRAQ 技術(shù)與PRM 驗(yàn)證技術(shù)，對(duì)三個(gè)成熟時(shí)期的煙葉進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為揭示煙葉衰老機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用烤煙品種為K326，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。于2018 年4 月至9 月種植于云南省玉溪市紅塔區(qū)研和試驗(yàn)基地（102°29’58″E，24°14’21″ N，海拔1635 m），采用隨機(jī)取樣法，選取未熟-IM（移栽后85 天）、適熟-WM（移栽后92 天）和過(guò)熟-OM（移栽后97 天）3 個(gè)時(shí)期中部葉片作為分析材料，3 個(gè)時(shí)期樣品各2 次重復(fù)共6 份樣品。

1.2 酶活性測(cè)定

在Giannopolitis等[9]所描述的方法基礎(chǔ)上略作修改，進(jìn)行酶提取。選取不同時(shí)期中部新鮮葉片1 g，放在3 mL的0.05 mol·L-1磷酸鈉緩沖液中研磨成勻漿，磷酸鈉緩沖液包括1 mL MEDTA和2%（w/v）PVP，pH值為7.8。勻漿在4℃下13000 g離心20 min，利用上清液測(cè)定酶活性，所有步驟均在4℃下進(jìn)行。超氧化物歧化酶（SOD）采用硝基四氮唑藍(lán)還原法測(cè)定[10]。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定[11]。過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定?？箟难徇^(guò)氧化物酶（APX）活性采用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

參照Xie 等[12]的方法分別對(duì)未熟、適熟和過(guò)熟煙葉進(jìn)行全蛋白質(zhì)提取。對(duì)提取后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行還原烷基化處理，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定[13]。按1 ∶50 的質(zhì)量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37℃酶解過(guò)夜，酶解后的肽段用C18 柱脫鹽，真空冷凍干燥脫鹽后的肽段。根據(jù)iTRAQ-8標(biāo)試劑盒（AB SCIEX，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記，IM-1,115；IM-2,116；WM-1,117；WM-2,118；OM-1,119；OM-2,121。將標(biāo)記后的樣品混合，應(yīng)用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）對(duì)混合后的肽段進(jìn)行預(yù)分離，然后再進(jìn)行液相分離和色譜分析。

1.4 差異蛋白的選擇

使用與AB Sciex 5600 plus 配套的搜索引擎—Proteinpilot TM V4.5。對(duì)于proteinpilot 的鑒定結(jié)果，進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾，對(duì)于鑒定到的蛋白，認(rèn)為unused score ≥1.3（即可信度水平在95%以上），每個(gè)蛋白至少包含一個(gè)不同肽段的蛋白為可信蛋白；對(duì)于鑒定的肽段和蛋白質(zhì)定量，我們以conf.≥95 過(guò)濾，即可信度在95%以上認(rèn)為可信肽段用于蛋白質(zhì)定量。通過(guò)兩兩對(duì)比獲取顯著差異蛋白，根據(jù)BH 校正法，對(duì)原數(shù)據(jù)進(jìn)行P-value ≤0.05 校正，將差異倍數(shù)≥1.2 或者≤0.83 倍時(shí)視為表達(dá)差異蛋白[14]。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.6 PRM 驗(yàn)證

根據(jù)iTRAQ 結(jié)果，采用LC-MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)煙草樣品中12 個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量比較。采用基于質(zhì)譜的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（parallel reaction monitoring, PRM）對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行靶向定量分析，通過(guò)非連續(xù)變形分析（discontinuous deformation analysis, DDA）檢測(cè)后，將鑒定到的目標(biāo)蛋白的肽段加入質(zhì)譜采集方法的輸入列表（inclusion list）中，使質(zhì)譜針對(duì)這些特定肽段進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通過(guò)抽提碎片離子信息進(jìn)行靶向相對(duì)定量分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用EXCEL 2016、SPSS 22.0 和Origin 8.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種抗氧化酶酶活性變化

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，抗氧化酶維持著植物體內(nèi)活性氧（ROS）的動(dòng)態(tài)平衡[15]。由圖可知，隨著煙葉成熟度的增加， 4 種抗氧化酶活性均呈先增加后下降的趨勢(shì)，表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟。

2.2 蛋白質(zhì)的iTRAQ 鑒定分析

圖2 為蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)定量結(jié)果，二級(jí)圖譜總數(shù)為435604，匹配到的圖譜數(shù)量為158095，鑒定到的肽段的數(shù)量為23346，鑒定到特有肽段序列的數(shù)量為3292，鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量為4747。

圖1 煙葉不同時(shí)期抗氧化酶活性Fig. 1 Antioxidant enzyme activities of tobacco leaves at different stages

圖2 iTRAQ 鑒定的蛋白信息Fig. 2 Protein information identified by iTRAQ

2.3 三個(gè)對(duì)比組間蛋白質(zhì)定量分析

在全蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上，將生物學(xué)重復(fù)得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)合并，將其共同表達(dá)的蛋白質(zhì)用于差異蛋白篩選。其中，在OM vs IM 對(duì)比組中，共鑒定出 321 種共同差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)122 種（P ≤0.05，fold change ＞1.2）， 下 調(diào)199 種（P ≤0.05，fold change ＜0.83）（圖3A）。在OM vs WM 中，共鑒定到差異表達(dá)蛋白種類(lèi)為319，124 種蛋白表達(dá)上調(diào)，195 中蛋白表達(dá)下調(diào)（圖3B）。在WM vs IM 中，存在223 種差異表達(dá)蛋白，125 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，98中蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)（圖3C）。

2.4 差異蛋白質(zhì)GO 功能注釋

針對(duì)不同組別差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋分析，分別從生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能進(jìn)行注釋。圖4A 表示過(guò)熟煙葉與未熟煙葉中差異蛋白GO 注釋結(jié)果，OM vs IM 差異蛋白參與了23 個(gè)生物過(guò)程、9 個(gè)細(xì)胞組成和9 個(gè)分子功能。在生物過(guò)程分類(lèi)中，代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程占據(jù)較大的比例。此外，上調(diào)蛋白質(zhì)參與節(jié)律過(guò)程（rhythmic process）和病毒繁殖（viral reproduction），下調(diào)蛋白質(zhì)參與生長(zhǎng)發(fā)育（growth）、碳固定（carbon utilization）和色素沉著（pigmentation）等過(guò)程；在細(xì)胞組成分類(lèi)中，大部分差異蛋白質(zhì)位于細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器中，上調(diào)蛋白質(zhì)參與構(gòu)成細(xì)胞外區(qū)部分（extracellular region part）細(xì)胞組分；在分子功能分類(lèi)中，催化活性和連接活性所占比例較高，下調(diào)蛋白質(zhì)存在電子載體活性（electron carrier activity）、分子轉(zhuǎn)換器活動(dòng)（molecular transducer activity）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）3 種功能。

圖3 火山圖表示不同時(shí)期樣品間蛋白質(zhì)豐度變化Fig. 3 Volcanic chart of protein abundance change of samples at different stages

圖4B 是過(guò)熟煙葉與適熟煙葉差異蛋白質(zhì)GO 功能注釋結(jié)果，OM vs WM 差異蛋白質(zhì)參與了24 個(gè)生物過(guò)程、11 個(gè)細(xì)胞組成和9 個(gè)分子功能。在生物過(guò)程中，差異蛋白質(zhì)在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程所占比例較高，上調(diào)蛋白質(zhì)參與氮利用率（nitrogen utilization）和節(jié)律過(guò)程（rhythmic process），下調(diào)蛋白參與色素沉著（pigmentation）和碳固定（carbon utilization）兩種生物過(guò)程；在細(xì)胞組成中，大部分差異蛋白質(zhì)位于細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器中；在分子功能中，催化活性所占比例較大，下調(diào)蛋白具有電子載體活動(dòng)（electron carrier activity）、分子傳導(dǎo)活動(dòng)（molecular transducer activity）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）3 種分子功能。

圖4C 為適熟煙葉與未熟煙葉差異蛋白質(zhì)GO 功能注釋結(jié)果，WM vs IM 差異蛋白參與了20 個(gè)生物過(guò)程、11 個(gè)細(xì)胞組成和9 個(gè)分子功能。在生物過(guò)程中，差異蛋白質(zhì)在代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程等過(guò)程所占比例較大；在細(xì)胞組成分類(lèi)中，大部分差異蛋白質(zhì)位于細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器中；在分子功能分類(lèi)中，催化活性和連接活性所占比例較大，上調(diào)蛋白存在酶調(diào)節(jié)劑活性功能（enzyme regulator activity），下調(diào)蛋白具有分子轉(zhuǎn)換器活性（molecular transducer activity）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）兩種分子功能。

1.請(qǐng)家長(zhǎng)來(lái)學(xué)校了解教學(xué)情況和學(xué)生的學(xué)習(xí)情況。針對(duì)不同層次的學(xué)生使用不同的方式請(qǐng)家長(zhǎng)參觀學(xué)校，對(duì)成績(jī)良好但思想不太優(yōu)秀的學(xué)生說(shuō)：“你的學(xué)習(xí)成績(jī)是優(yōu)秀的，老師想讓你更優(yōu)秀，老師需要和你的父母討論一些其他方面的問(wèn)題?！睂?duì)有一技之長(zhǎng)的后進(jìn)生說(shuō)：“你擅長(zhǎng)體育（音樂(lè)、繪畫(huà)等），如果你深入學(xué)習(xí)，然后去上一個(gè)更高層次的學(xué)校，你將有一個(gè)強(qiáng)有力的立足于社會(huì)的技能?！焙?jiǎn)單的教育方式蘊(yùn)涵著一個(gè)樸素的教育理念——相信學(xué)生，教育學(xué)生的全部秘密在于相信學(xué)生和解放學(xué)生。相信學(xué)生、解放學(xué)生，首先要賞識(shí)學(xué)生。

2.5 差異蛋白質(zhì)KEGG 富集分析

通過(guò)KEGG pathway 顯著性富集發(fā)現(xiàn)，差異蛋白質(zhì)顯著富集于代謝途徑（Metabolic pathways）、不同環(huán)境中的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）、光合作用（Photosynthesis）等代謝途徑。在OM vs IM 中，上調(diào)蛋白質(zhì)顯著富集于絡(luò)氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、異喹啉生物堿的生物合成（Isoquinoline alkaloid biosynthesis）等代謝途徑。下調(diào)蛋白質(zhì)顯著富集于光合作用（Photosynthesis）、代謝途徑（Metabolic pathways）、光合生物中的固碳作用（Carbon fixation in photosynthetic organisms）等代謝途徑（圖5A）。

在OM vs WM 中，上調(diào)蛋白質(zhì)顯著富集于絡(luò)氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、異喹啉生物堿的生物合成（Isoquinoline alkaloid biosynthesis）等代謝途徑中。下調(diào)蛋白質(zhì)顯著富集于光合作用（Photosynthesis）、代謝途徑（Metabolic pathways）等代謝途徑（圖5B）。

圖4 差異蛋白質(zhì)GO 注釋結(jié)果Fig. 4 GO annotation results of differentially expressed protein

在WM vs IM 中，上調(diào)蛋白質(zhì)顯著富集于次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、異喹啉生物堿的生物合成（Isoquinoline alkaloid biosynthesis） 等 代 謝 途 徑。 下 調(diào) 蛋 白質(zhì)參與光合生物中的碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、光合作用（Photosynthesis）等代謝途徑（圖5C）。

圖5 差異蛋白通路富集分析顯著性統(tǒng)計(jì)圖Fig. 5 Statistical graph of significance of enrichment analysis of differentially expressed protein pathway

2.6 三組間共同差異蛋白

比較三個(gè)對(duì)比組OM vs IM、OM vs WM 與WM vs IM 的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)86 個(gè)共同差異表達(dá)蛋白（圖6）。對(duì)比3 個(gè)成熟時(shí)期（IM、WM、OM）86 個(gè)共同差異蛋白的表達(dá)豐度值（Z-score 處理）。在熱圖中，紅色部分代表上調(diào)，藍(lán)色部分代表下調(diào)。其中有17 個(gè)蛋白質(zhì)包括A0A1S4DCM1、A0A1S4C433、A0A1S3ZQP6 等隨著煙葉的衰老，其表達(dá)呈增加趨勢(shì)，有29 個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)（包括Q1WL43、A0A1S4AKK6、A0A140G1P2 等）隨著煙葉的衰老呈下降趨勢(shì)（圖7）。此類(lèi)蛋白質(zhì)可能是煙葉衰老潛在靶標(biāo)蛋白。

圖 6 3 組間共同差異表達(dá)蛋白Fig. 6 Common differentially expressed proteins between groups

2.7 PRM 驗(yàn)證

在本研究中，根據(jù)iTRAQ 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用了PRM 靶向策略，對(duì)12 個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，整體結(jié)果顯示較好。在比較OM vs IM 的差異蛋白質(zhì)驗(yàn)證中，有6 個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，6 個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，和iTRAQ 定量結(jié)果比較，有10 個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為表達(dá)量變化水平一致，2 個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相反（圖8A）。在比較組OM vs WM 的差異蛋白質(zhì)驗(yàn)證中，7 個(gè)差異蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，5 個(gè)差異蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，與iTRAQ 定量結(jié)果相比，有9 個(gè)差異蛋白質(zhì)表現(xiàn)為表達(dá)量變化水平一致，3 個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相反（圖8B）。在比較組WM vs IM的差異蛋白驗(yàn)證中，有6個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，6 個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，與iTRAQ 定量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比時(shí)，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為表達(dá)量變化水平一致，2個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)相反（圖8C）。驗(yàn)證結(jié)果表明，有6 個(gè)蛋白質(zhì)在3 組間均表現(xiàn)為與iTRAQ 定量結(jié)果一致的趨勢(shì)， 包 括Q1WL43、A0A1S4DCM1、A0A1S4C433、A0A1S4AKK6、A0A1S3ZQP6、A0A140G1P2。

圖7 3 個(gè)成熟時(shí)期中86 個(gè)差異蛋白的熱圖Fig. 7 Heat maps of the 86 differentially expressed proteins at three stages

圖 8 PRM 驗(yàn)證結(jié)果Fig. 8 PRM verification results

3 討論

葉片衰老是一個(gè)受基因調(diào)控的復(fù)雜而有序的生理活動(dòng)過(guò)程[16]。葉片顏色由綠變黃、合成代謝減弱而分解代謝加強(qiáng)、蛋白質(zhì)及大分子物質(zhì)的降解是葉片衰老過(guò)程中的重要表現(xiàn)[17]。本研究結(jié)合煙葉衰老過(guò)程中抗氧化酶活性和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討了煙葉衰老過(guò)程中的生理變化和蛋白質(zhì)組學(xué)變化。

一般情況下，活性氧是植物發(fā)育性細(xì)胞程序性死亡的重要信號(hào)分子[18]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，抗氧化酶參與活性氧的清除過(guò)程，平衡植物體內(nèi)活性氧含量[19]。隨著煙葉的衰老，抗氧化酶包括SOD、CAT、POD 和APX 活性呈先增加后下降的趨勢(shì)。說(shuō)明在煙葉衰老初期，抗氧化酶還保持一定的活性，但隨著煙草植株各生理代謝的減弱，抗氧化酶活性顯著下降。該研究結(jié)果與小麥[20]，甜瓜[21]等作物的研究結(jié)果一致。

在GO 分析中，差異蛋白質(zhì)涉及代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程，存在于細(xì)胞、細(xì)胞組分等部位，有催化活性、綁定活性等功能。KEGG 通路分析表明，不同時(shí)期煙葉差異蛋白主要參與代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、光合作用、次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝途徑。其中，在代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、光合作用中，下調(diào)蛋白所占比例較大，說(shuō)明在煙葉衰老過(guò)程中，代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、光合作用等代謝途徑代謝強(qiáng)度下降。

在86 個(gè)差異蛋白聚類(lèi)分析中，大量差異蛋白參與代謝途徑，如A0A1S4AKK6（Chlorophyll a-b binding protein，chloroplastic， 葉 綠 素a-b 結(jié) 合 蛋白， 葉 綠 體）、A0A1S3ZQP6（polyphenol oxidase E, chloroplastic-like isoform X1，多酚氧化酶E，類(lèi)葉 綠 素X1）、A0A1S3X216（polyphenol oxidase E, chloroplastic-like，多酚氧化酶E，類(lèi)葉綠體）等。葉綠素a/b 結(jié)合蛋白是植物光系統(tǒng)中與植物色素分子結(jié)合的一系列蛋白，具有捕獲光能、傳遞能量以及響應(yīng)各種脅迫的功能[22]。該類(lèi)蛋白在煙葉衰老過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明煙葉捕獲光能的能力減弱。多酚氧化酶與類(lèi)囊體膜結(jié)合，大量存在于植物體內(nèi)，易發(fā)生聚合作用生成醌類(lèi)物質(zhì)，還具有促進(jìn)清除活性氧的功能[23]。該類(lèi)蛋白在煙葉衰老過(guò)程表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明煙葉衰老葉色變化可能與葉內(nèi)多酚氧化酶相關(guān)，也可能是因?yàn)槿~內(nèi)活性氧含量增加，導(dǎo)致該類(lèi)蛋白呈增加趨勢(shì)。

86 個(gè)差異蛋白質(zhì)中，與煙葉衰老過(guò)程光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)有A0A140G1P2（Photosystem II protein D1，光系統(tǒng)II 蛋白D1）、D2K7Z2（Photosystem I reaction center subunit，光系統(tǒng)I 反應(yīng)中心亞基）、A0A140G1R2（Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A2， 光 系 統(tǒng)I P700 葉 綠 素 載 脂 蛋 白A2）、A0A1S4CFV4（photosystem I reaction center subunit IV A，chloroplastic，光系統(tǒng)I 反應(yīng)中心IV A亞單元，葉綠體）等。光合作用的光反應(yīng)發(fā)生在葉綠體類(lèi)囊體膜上，光系統(tǒng)I、光系統(tǒng)II、細(xì)胞色素b6f復(fù)合體（Cyt b6f）、ATP 合酶等復(fù)合物參與光合作用中電子傳遞[24]。4 個(gè)光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)均表現(xiàn)為下調(diào)，說(shuō)明在煙葉衰老過(guò)程中，光合過(guò)程電子傳遞受阻，從而影響光合作用的順利進(jìn)行。

在PRM 驗(yàn)證中，三個(gè)對(duì)比組選擇12 個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，分別存在10/9/10 個(gè)趨勢(shì)與iTRAQ 結(jié)果一致的蛋白，說(shuō)明iTRAQ 定量結(jié)果可靠，驗(yàn)證了iTRAQ 結(jié)果的可靠性。6 個(gè)蛋白質(zhì)在3 組間均表現(xiàn)為與iTRAQ結(jié)果一致的趨勢(shì)，包括Q1WL43、A0A1S4DCM1、A0A1S4C433、A0A1S4AKK6、A0A1S3ZQP6、A0A140G1P2 可能是煙葉衰老潛在靶標(biāo)蛋白。

4 結(jié)論

（1）煙葉衰老過(guò)程中抗氧化酶包括SOD、CAT、POD 和APX 活性在煙葉成熟的3 個(gè)時(shí)期存在顯著差異。

（2）煙葉衰老過(guò)程中，共鑒定出4747 個(gè)定量蛋白，過(guò)熟與未熟煙葉相比找到321 個(gè)差異蛋白，包括122 個(gè)上調(diào)蛋白與199 個(gè)下調(diào)蛋白。過(guò)熟與適熟煙葉相比，有319 個(gè)差異蛋白，其中124 個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)，195 個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)。適熟與未熟相比，發(fā)現(xiàn)223 個(gè)差異蛋白質(zhì)，包括125 個(gè)上調(diào)蛋白和98 個(gè)下調(diào)蛋白。

（2）GO功能注釋中，差異蛋白質(zhì)主要參與代謝過(guò)程（metabolic process）、細(xì)胞過(guò)程（cellular process）等生物過(guò)程；構(gòu)成細(xì)胞（cell）、細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）等細(xì)胞組成；主要的分子功能有催化活性（catalytic activity）、結(jié)合（binding）等。

（3）在KEGG 功能富集中，差異蛋白質(zhì)顯著富集于代謝途徑、光合作用、次生代謝產(chǎn)物的生物合成代謝途徑。

（4）PRM 驗(yàn)證中，在對(duì)比組OM vs IM，OM vs WM 和WM vs IM 中，分別有10/9/10 個(gè)蛋白質(zhì)驗(yàn)證結(jié)果與iTRAQ 定量表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。6 個(gè)差異蛋白 包 括Q1WL43、A0A1S4DCM1、A0A1S4C433、A0A1S4AKK6、A0A1S3ZQP6、A0A140G1P2 可能是煙葉衰老潛在靶標(biāo)蛋白。