丁香玉，趙漫，王鵬偉，丁新華，儲(chǔ)昭輝，趙翔宇，李洋 ,

1 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安市岱宗大街61號(hào) 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安市岱宗大街61號(hào) 271018

羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）是一類?；?輔酶A-依賴的酰基轉(zhuǎn)移酶，具有?；荏w的特異性，是催化一咖啡?？崴嶙詈笠徊缴锖铣傻年P(guān)鍵酶，催化咖啡酰輔酶 A和奎尼酸進(jìn)行酯交換生成一咖啡?？崴醄1]。

一咖啡?？崴崾窃S多植物中重要的苯丙酸，包括煙草，番茄，馬鈴薯,蘋果等[2-4]。根據(jù)咖啡?；诳崴嵘系慕Y(jié)合部位不同，一咖啡?？崴峥煞譃槎喾N異構(gòu)體：1-咖啡?？崴幔?-CQA）、3-咖啡?？崴幔?-CQA）、4-咖啡酰奎尼酸（4-CQA）和5-咖啡?？崴幔?-CQA，CGA，綠原酸）。1-CQA 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是 NF-?B 途徑的潛在抑制因子，具有抗癌能力。3-CQA 在人類膳食中普遍存在，可以有效的預(yù)防肝臟系統(tǒng)疾病、高血壓血脂癥、肥胖等疾病[5-6]。4-CQA則具有非常強(qiáng)的消炎作用[7]。5-CQA 是其中最主要的一種同分異構(gòu)體，在人體健康中發(fā)揮重要作用，能夠減緩葡萄糖向血液中的釋放，具有預(yù)防、降低心臟病和Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的作用[8-10]。綠原酸還是重要的天然抗氧化劑，能夠幫助植物細(xì)胞抵御低溫、紫外線等各種非生物脅迫以及病原，害蟲(chóng)侵害等生物脅迫[11]。目前在煙草葉片中只檢測(cè)出3-CQA，4-CQA 和5-CQA 三種一咖啡?？崴醄12]。

黃酮醇作為重要的苯丙烷類物質(zhì)，廣泛存在于多種茄科作物中，包括煙草，番茄，馬鈴薯等[13]。在煙草中主要是蘆丁和山奈酚蕓香糖苷，但含量極少，在人體中具有強(qiáng)抗氧化、清除人體自由基和抗菌消炎等多種作用[14]。對(duì)植物自身而言，黃酮醇類物質(zhì)能夠增強(qiáng)植物抗性，幫助植物抵抗各種生物和非生物脅迫，如病蟲(chóng)侵害和環(huán)境逆境等[15-17]。本文旨在分析HQT 基因?qū)煵荽紊x物質(zhì)的影響，獲得富含一咖啡?？崴岬霓D(zhuǎn)基因煙草，并探究HQT 基因?qū)S酮醇生物合成的影響，對(duì)煙草次生代謝機(jī)制進(jìn)行初步研究，為培育富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且具有更強(qiáng)抗逆能力的煙草做基礎(chǔ)鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

三生煙（Nicotiana tabacum cv. samsun），植株在25℃，16 h/8 h 光暗周期，相對(duì)濕度為（70±10）%的溫室內(nèi)培養(yǎng)。煙草在營(yíng)養(yǎng)缽中生長(zhǎng)至8 葉期，取中部葉片進(jìn)行檢測(cè)。

大腸桿菌Escherichia coli DH5ɑ，農(nóng)桿菌LBA4404和真核表達(dá)載體pCXSN 均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 方法

1.2.1 NtHQT 基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

采用TRI Reagent （Sigma，美國(guó)）提取三生煙草（Nicotiana tabacum cv. samsun）葉片總RNA，取1 μg 總RNA 用DNaseI（NEB，美國(guó)）37℃處理15 min，75℃酶滅活10 min，去除基因組DNA，作為RNA 模板。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，日本），向RNA 模板中加入2 μL 5 × RT Master Mix Ⅱ，RNase-free ddH2O 補(bǔ)充至10 μL，37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，98℃酶滅活5 min，獲得cDNA，置于-20℃保存。

以上述反應(yīng)得到的cDNA 為模板，根據(jù)煙草HQT基因序列（GeneBank AJ582651）和EST 序列特征，設(shè)計(jì)NtHQT 基因引物，引物序列為NtHQT-F：5’-ATGGGAAGTGAAAAAATGAT-3’ 和NtHQT-R：5’-CAAAATTCATACAAATACTTCT-3’ （華大基因股份有限公司，深圳）。采用LAmp 高保真DNA 聚合酶（康為，北京）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：50 ng 模板，1 U DNA 聚合酶，5 μL 10×PCR 緩沖液，5 μL dNTPs （2 mmol/L），1 μL 引物（10 μmol/L），3 μL MgSO4，ddH2O 補(bǔ)充至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，35 個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸90 s（30-60 s/kb），擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收?；厥蘸驨tHQT 基因片段和實(shí)驗(yàn)室保存的表達(dá)載體pCXSN，用Xcm I（NEB，美國(guó)）分別進(jìn)行酶切，純化后將載體和目的基因片段用T4 DNA 連接酶（ThermoFisher Scientific，美國(guó)）進(jìn)行連接，形成遺傳轉(zhuǎn)化載體pCXSN::NtHQT。轉(zhuǎn)化載體熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ，挑白斑進(jìn)行菌落PCR 初篩，挑選陽(yáng)性克隆過(guò)夜擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒送至公司（華大基因股份有限公司，深圳）測(cè)序。經(jīng)測(cè)序無(wú)誤后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

選取煙草葉片作為外植體，采用農(nóng)桿菌（LBA4404）介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法[18]，將已構(gòu)載體pCXSN::NtHQT轉(zhuǎn)化三生煙草受體材料。待生根培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因煙草根系發(fā)育良好時(shí)，移栽到土壤中。采用C TA B[19]法提取植株葉片基因組D N A，以3 5 S 啟動(dòng)子內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物35S-F：5’-ACGCACAATCCCACTATCCTT-3’和基因內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物N t H Q T - R ：5’-TCAAAATTCATACAAATACTTCT-3’進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增出1438 bp片段，為陽(yáng)性植株。

1.2.3 一咖啡?？崴岷忘S酮醇物質(zhì)提取和HPLC 含量測(cè)定

取轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片用液氮研磨至粉末狀，各取0.3 g，3 mL 100%色譜級(jí)甲醇-20℃萃取2 h，每15 min 振蕩1 次。4℃、4000 r/min 離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾至樣品瓶，取10 μL 過(guò)濾液用于HPLC 檢測(cè)分析[20-21]，標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁，1-咖啡酰奎尼酸，3-咖啡?？崴?，4-咖啡?？崴幔?-咖啡?？崴幔⊿igma），山奈酚蕓香糖苷（Extrasynthese）。野生型和轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)至8 葉期，取中部3 片真葉進(jìn)行檢測(cè)。T0代煙草每株檢測(cè)重復(fù)3 次；T1代煙草每個(gè)株系3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 NtHQT 基因克隆和基因表達(dá)載體構(gòu)建

按照三生煙草中NtHQT 的已知序列設(shè)計(jì)引物，以三生煙草葉片cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得長(zhǎng)為1311 bp 的清晰目標(biāo)序列（圖1A），切膠回收后酶切，連接X(jué)cm I 酶切后的pCXSN 載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ，通過(guò)35S 啟動(dòng)子內(nèi)部序列引物35S-F 和基因序列內(nèi)部引物NtHQT-R 對(duì)白色克隆進(jìn)行PCR 陽(yáng)性驗(yàn)證（圖1B），擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為1438 bp 的目標(biāo)條帶，選取3 個(gè)陽(yáng)性克隆過(guò)夜擴(kuò)繁后提質(zhì)粒測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列NtHQT（GeneBank AJ582651）和pCXSN 載體35S 啟動(dòng)子進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)成功，確認(rèn)成功克隆NtHQT 的完整基因序列，并成功構(gòu)建pCXSN::NtHQT 載體。

圖1 NtHQT 片段擴(kuò)增電泳及菌落PCR 檢測(cè)圖Fig. 1 NtHQT fragment amplification electrophoresis and PCR detection of colony

2.2 NtHQT 基因遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

將構(gòu)建成功的遺傳轉(zhuǎn)化載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌LBA4404，通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入三生煙草中，獲得轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草。通過(guò)PCR 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)（圖2），在獲得的15 株轉(zhuǎn)基因材料中，有11株擴(kuò)增到了長(zhǎng)度為1438 bp 的目標(biāo)條帶，確認(rèn)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為73.3%。轉(zhuǎn)基因煙草在表型上與野生型沒(méi)有明顯差異（圖3）。

圖2 T0 代 轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草陽(yáng)性檢測(cè)Fig. 2 Positive detection of NtHQT transgenic tobacco in T0 generation

圖3 T1 代三個(gè)不同株系轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草表型Fig. 3 Phenotype between three different lines of NtHQT transgenic tobacco in T1 generation and wild-type tobacco

2.3 煙草葉片一咖啡?？崴岷忘S酮醇物質(zhì)含量檢測(cè)

待煙草葉片生長(zhǎng)至8 葉期，參照Luo[21]等HPLC 檢測(cè)苯丙烷類物質(zhì)含量的方法，對(duì)部分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行含量檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)NtHQT 基因的煙草葉片中一咖啡酰奎尼酸、蘆丁、山奈酚蕓香糖苷的含量都有不同程度的提高（圖4，表1）。

圖4 T0 代轉(zhuǎn)基因煙草葉片一咖啡?？崴峒包S酮醇含量HPLC 檢測(cè) Fig. 4 HPLC analysis of CQAs and flavonols contents in NtHQT transgenic tobacco leaves in T0 generation and wild-type

其中，轉(zhuǎn)NtHQT 基因的煙草葉片一咖啡?？崴岬暮刻岣吡?.04～7.28 倍，最高含量達(dá)487.00 μg/g (FW)。蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高分別可達(dá)208.00 μg/g (FW)和52.00 μg/g (FW)，分別是相同條件下野生型三生煙草葉片中含量的17.83倍和4.3倍。

在T0代陽(yáng)性植株中隨機(jī)選擇3 個(gè)株系，編號(hào)為NtHQT-1，NtHQT-2 和NtHQT-3，收取種子后進(jìn)行T1代種植及陽(yáng)性檢測(cè)。每個(gè)株系取3 棵生物學(xué)重復(fù)，對(duì)陽(yáng)性植株葉片進(jìn)行含量測(cè)定。轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株三種物質(zhì)含量變化倍數(shù)與T0代基本一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草富含一咖啡?？崴峒包S酮醇的優(yōu)勢(shì)可以穩(wěn)定遺傳（圖 5，表 2）。

表1 轉(zhuǎn)基因煙草T0 代葉片中各物質(zhì)含量Tab. 1 Quantification of CQAs and flavonols in NtHQT-expressing tobacco leaves in T0 generation and wild-type (SS)

表2 轉(zhuǎn)基因煙草T1 代葉片中各物質(zhì)含量Tab. 2 Quantification of CQAs and flavonols in NtHQT-expressing tobacco leaves in T1 generation and wild-type (SS)

圖5 T1 代轉(zhuǎn)基因煙草葉片一咖啡?？崴峒包S酮醇含量HPLC 檢測(cè)Fig. 5 HPLC analysis CQAs and flavonols contents of NtHQT transgenic tobacco leaves in T1 generation and wide-type

3 結(jié)論與討論

已有文章報(bào)導(dǎo)，HQT 基因參與多種植物綠原酸的生物合成。Lepelley M 等通過(guò)分析咖啡中HQT 的時(shí)空表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其與綠原酸積累和分布的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)[1]。Raja S 在馬鈴薯中通過(guò)RNAi 對(duì)HQT 的抑制導(dǎo)致綠原酸下降90%以上[22]，結(jié)果均表明NtHQT基因可以正向調(diào)控綠原酸的生物合成。本研究將煙草自身的HQT基因連接35S啟動(dòng)子構(gòu)建真核表達(dá)載體，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)基因煙草，不僅綠原酸含量明顯提高，其他兩種一咖啡?？崴岷恳泊蠓忍岣摺６豢Х弱？崴岵粌H能夠幫助植物增強(qiáng)對(duì)各種生物及非生物脅迫的抗性[11]，還在人體健康中發(fā)揮重要作用，能夠抗菌消炎，預(yù)防肥胖和心腦血管疾病等[5-6]。一咖啡?？崴崴哂械墓πВ谝欢ǔ潭壬嫌锌赡芙档臀鼰煂?duì)消費(fèi)者造成的衰老、心血管疾病等危害。

蘆丁，山奈酚蕓香糖苷均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在人體中具有清除自由基，抵抗衰老的功能；在植物中能夠增強(qiáng)植物對(duì)多種病原菌的抗性[23]，幫助植物抵御多種生物與非生物脅迫，但在煙草中含量很少。本實(shí)驗(yàn)獲得的轉(zhuǎn)NtHQT 基因煙草，除檢測(cè)到一咖啡酰奎尼酸含量最高可提高10.34 倍外，蘆丁，山奈酚蕓香糖苷含量也有大幅度提高，暗示黃酮醇合成相關(guān)通路可能被激活。

已有研究表明，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷等黃酮醇物質(zhì)合成與一咖啡?？崴岷铣陕窂焦蚕矶喾N中間酶和前期次生代謝物：以苯丙氨酸為合成底物，經(jīng)過(guò)PAL（L-苯丙氨酸解氨酶）、C4H（肉桂酸羥化酶）、4CL（p-香豆酰-CoA 合成酶）催化合成p-香豆酸輔酶A。然后以p-香豆酰輔酶A 為底物，通過(guò)多種酶分別催化合成一咖啡?？崴?，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷等[21]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)HQT 基因煙草葉片中一咖啡?？崴岬暮孔罡呖商岣?0.34 倍，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高可分別提高17.83和16.97倍，推測(cè)，煙草HQT 基因的超量表達(dá)可能激活一咖啡酰奎尼酸合成路徑中上游PAL、C4H、4CL 酶以及前期代謝物質(zhì)苯丙氨酸和p-香豆酸輔酶A 的積累，這些合成相關(guān)酶及代謝物質(zhì)的增多，同時(shí)促進(jìn)下游多種黃酮醇合成酶的反應(yīng)，從而更強(qiáng)激活蘆丁和山奈酚蕓香糖苷合成路徑，而這些黃酮醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化情況有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)對(duì)煙草一咖啡?？崴岷铣申P(guān)鍵基因HQT的研究發(fā)現(xiàn)，HQT 基因不僅參與調(diào)控一咖啡?？崴岬暮铣?，也正向調(diào)控?zé)煵葜刑J丁和山奈酚蕓香糖苷的生物合成，有助于了解煙草中次生代謝物質(zhì)，尤其是一咖啡?？崴峒包S酮醇物質(zhì)的合成機(jī)理，并為在實(shí)際生產(chǎn)中提升煙草品質(zhì)和抗逆能力提供研究基礎(chǔ)。