張磊，唐永凱,2，李紅霞,2，徐逾鑫，李迎賓，俞菊華,2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214128；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214128)

白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)家族是一類(lèi)促炎因子，在宿主防御及各種自身免疫性疾病中有重要作用[1]。哺乳動(dòng)物IL-17 家族成員包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E 和IL-17F[2]。GUNIMALADEVI 等[3]于2006 年在斑馬魚(yú)上克隆到IL-17，開(kāi)啟了魚(yú)類(lèi)IL-17 基因鑒定及其功能的研究。在魚(yú)類(lèi)中，除IL-17E 外的IL-17家族其他基因已被分離和鑒定。IL-17N 只在硬骨魚(yú)類(lèi)中被發(fā)現(xiàn)[4]。目前，對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)IL-17N 的研究主要集中在基因結(jié)構(gòu)、基因克隆等方面，對(duì)其功能研究相對(duì)較少。

通過(guò)原核表達(dá)獲得可溶的鯉魚(yú)IL-17N 重組蛋白，可為進(jìn)一步揭示鯉魚(yú)IL-17N 的功能提供研究材料。目前，真核基因在原核中的表達(dá)多采用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)。但原核細(xì)胞缺少真核蛋白折疊所需的酶，導(dǎo)致外源蛋白在原核表達(dá)中常以無(wú)生物活性的包涵體形式表達(dá)[5-6]。大量研究[7-8]表明，促溶標(biāo)簽的應(yīng)用及表達(dá)條件的優(yōu)化能提高外源蛋白的可溶性表達(dá)。本研究中，通過(guò)對(duì)鯉魚(yú)IL-17N重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及促溶標(biāo)簽的選擇，獲得可溶的鯉魚(yú)IL-17N 重組蛋白，旨在為鯉魚(yú)IL-17N的功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌(Escherichia coli) DH5α 及Transetta (DE3)購(gòu)自TransGen Biotech；原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX- GST、pCold-SUMO、pMAL-c2X 購(gòu)自杭州研真生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ、SalⅠ及DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海博彩生物科技有限公司；蛋白質(zhì)Marker 購(gòu)自賽默飛世爾科技。鎳柱購(gòu)自無(wú)錫天演生物技術(shù)有限公司。

1.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將質(zhì)粒pGEX-GST 雙酶切獲得的GST 片段插入到質(zhì)粒pCold-SUMO 的SUMO 融合標(biāo)簽之后，轉(zhuǎn)化到E. coilDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。利用菌液PCR 和雙酶切鑒定，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序準(zhǔn)確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒，標(biāo)記為pCold-SUMO-GST。

以CcIL–17N基因的T-克隆質(zhì)粒為模板，根據(jù)已有鯉魚(yú)cDNA 序列，設(shè)計(jì)引物，即IL-17N-R，5′-ACGCGTCGACCTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GATTCTGTCTGGATGTGG-3′；IL-17N-F，5′-CGG GATCCAGTCCGATCATGGCCCAGTG-3′。在正、反向引物的5′端分別添加BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以鯉魚(yú)IL–17N基因的T-克隆質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。使用膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，經(jīng)BamH Ⅰ和SalⅠ酶切后，與被同樣酶切過(guò)的pGEX-GST、pCold-SUMO-GST、pMAL-c2X 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coilDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐抗性平板上涂布，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)菌液PCR 和雙酶切鑒定，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序準(zhǔn)確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒分別標(biāo)記為GST-17N、SUMO-GST- 17N、MBP-17N。

1.3 重組蛋白融合標(biāo)簽的選擇和誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將測(cè)序準(zhǔn)確的重組質(zhì)粒(GST-17N、SUMO- GST-17N、MBP-17N)分別轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于10 mL 含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜。次日，以1∶100 在含氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至吸光度為0.5～0.8 時(shí)，分別加入終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L 的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于20、25 ℃誘導(dǎo)2、4、6、8、12 h。離心收集細(xì)菌，并超聲裂解細(xì)菌后，取總菌和上清進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。以相同培養(yǎng)條件，但沒(méi)有添加誘導(dǎo)劑的總菌為對(duì)照。

1.4 重組蛋白純化及濃度測(cè)定

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SUMO-GST-17N 不能與GST 親和層柱結(jié)合，因此，上清裂解液用鎳柱親和層析，使用SCGTMUV-VIS Detector 分離純化，收集200 mmol/L 咪唑洗脫液洗脫產(chǎn)生峰值時(shí)的液體，收集液用SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。將收集液超濾濃縮于PBS中，考慮到鎳柱純化蛋白存在雜蛋白，參照王欽等[9]的方法，使用已知濃度的牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，根據(jù)目的帶與BSA 條帶灰度(Tanon GIS imagine)，計(jì)算純化后重組蛋白的質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)量和摩爾數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉魚(yú)IL–17N 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

菌液PCR 擴(kuò)增出的DNA 片段大小符合預(yù)期結(jié)果(342 bp，圖1)；重組表達(dá)質(zhì)粒(GST-17N、SUMO- GST-17N、MBP-17N)分別雙酶切后，獲得與目的基因(IL–17N)大小一致的DNA 片段(圖2)。

圖1 鯉魚(yú)IL–17N 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物 Fig.1 The amplification products of IL-17N of Cyprinus carpio

圖2 鯉魚(yú)原核重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果 Fig.2 The result of identification of recombinant prokaryotic expression plasmid

2.2 融合標(biāo)簽的促溶效果

如圖3 和圖4 所示，重組蛋白GST-17N(相對(duì)分子質(zhì)量為4.25×104)、SUMO-GST-17N(相對(duì)分子質(zhì)量為 5.54×104)、MBP-17N(相對(duì)分子質(zhì)量為6.08×104)的總菌均有表達(dá)，且大小與預(yù)測(cè)一致；重組蛋白MBP-17N、SUMO-GST-17N、GST-17N的可溶表達(dá)量依次降低，GST-17N 幾乎都是包涵體表達(dá)，SUMO-GST-17N、MBP-17N 上清蛋白占總蛋白比例分別為47.4%、87.0%。綜合考慮單位菌中可溶蛋白獲得量及試驗(yàn)需求，選擇MBP-17N 重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖3 GST–17N 和SUMO–GST–17N 的表達(dá)結(jié)果 Fig.3 The result of expression of GST-17N and SUMO-GST-17N

圖4 MBP–17N 的表達(dá)結(jié)果 Fig.4 The result of expression of MBP-17N

2.3 MBP–17N 蛋白的表達(dá)條件和表達(dá)量

如圖5 所示，IPTG 終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L 時(shí)，MBP-17N 重組蛋白總菌表達(dá)量沒(méi)有明顯差異，但可溶表達(dá)量有明顯差異，0.5 mmol/L 時(shí)可溶表達(dá)量最高；相同誘導(dǎo)條件下，25 ℃時(shí)MBP-17N 的總菌表達(dá)量高于20 ℃的。如圖6 所示，總菌表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在8 h 時(shí)達(dá)到最大后趨于穩(wěn)定?？梢?jiàn)，IPTG 濃度為0.5 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)8～12 h 時(shí)，重組蛋白MBP-17N 可溶表達(dá)量最高。

圖5 不同誘導(dǎo)溫度下不同濃度IPTG 誘導(dǎo)MBP-17N 的表達(dá)結(jié)果 Fig.5 The result of expression of MBP-17N with different concentrations of IPTG and different induction temperatures

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間下MBP-17N 總蛋白的表達(dá)結(jié)果 Fig.6 SDS-PAGE result of protein expression of MBP–17N with different induction time

2.4 MBP–17N 蛋白的質(zhì)量濃度

經(jīng)過(guò)鎳柱純化，得到MBP-17N 蛋白單一條帶與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明經(jīng)親和層析純化后得到較高純度的融合蛋白；質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL，即1 g總菌獲得0.09 mg 蛋白，融合蛋白摩爾數(shù)為1.61 nmol(圖7)。

圖7 MBP–17N 蛋白濃度的測(cè)定結(jié)果 Fig.7 The result of determination of MBP-17N protein concentration

3 結(jié)論與討論

姜媛媛等[10]利用SUMO 融合表達(dá)獲得了高純度的、有活性的鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-21、人FGF-21 和人白細(xì)胞介素IL-1β。RABHI-ESSAFI等[11]將人干擾素蛋白和GST 融合表達(dá)，獲得70%的可溶蛋白。在大腸埃希菌中以包涵體表達(dá)的95個(gè)哺乳動(dòng)物蛋白中，MBP 對(duì)其中的63 個(gè)有促溶效果[12]。本研究中，構(gòu)建GST-17N、SUMO-GST-17N和 MBP-17N 原核重組表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果表明，SUMO-GST、MBP 對(duì)目的蛋白均有明顯促溶作用，而GST 幾乎沒(méi)有促溶作用。這與RABHI-ESSAFI等[11]的研究結(jié)果有明顯差異，說(shuō)明同一融合標(biāo)簽對(duì)不同蛋白的促溶效果不同。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SUMO- GST-17N 不能與GST 親和層柱結(jié)合，推測(cè)可能是SUMO-GST 融合標(biāo)簽組合改變了GST 標(biāo)簽蛋白的構(gòu)象，降低了GST 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力。

誘導(dǎo)劑(IPTG)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度均是影響重組蛋白的可溶表達(dá)的重要因素[7]。柴政斌等[13]在優(yōu)化融合蛋白GST-PADI4(glutathione-peptidylarginine deiminase )Ⅳ表達(dá)條件中發(fā)現(xiàn)，溫度、IPTG 濃度對(duì)融合蛋白表達(dá)量無(wú)明顯影響，但可溶重組蛋白比例在16 ℃時(shí)明顯比37 ℃時(shí)高，IPTG 使用量在0.1～1.0 mmol/L 范圍內(nèi)，隨著IPTG 量的減少，可溶目的蛋白的比例隨之增加。在GST-CRH(corticotropinre- leasing hormone，CRH)的表達(dá)條件優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)的可溶蛋白含量明顯高于其他濃度的[14]。為獲得MBP-17N 的高可溶性表達(dá)，本研究對(duì)MBP-17N 的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，隨著IPTG 濃度的變化，MBP-17N 總蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯差異，但可溶表達(dá)量隨IPTG 濃度的升高，在0.5 mmol/L 時(shí)達(dá)到峰值后逐漸降低，這可能是由于IPTG 有細(xì)胞毒性，高濃度的IPTG 可能會(huì)導(dǎo)致融合蛋白快速、大量表達(dá)而形成包涵體[15]。低溫下大腸埃希菌生長(zhǎng)緩慢，一般選擇通過(guò)延長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間來(lái)增加融合蛋白的表達(dá)量，但隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌體的生長(zhǎng)會(huì)趨于停滯，融合蛋白的表達(dá)不會(huì)再明顯增加[13]。本研究中，MBP-17N 的總蛋白表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)增加至一定程度后趨于穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)表達(dá)條件的摸索，最終確定MBP-17N 的最佳可溶表達(dá)條件為0.5 mmol /L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)8～12 h。

由于MBP 與直鏈淀粉樹(shù)脂結(jié)合效率較低，蛋白回收率的效率過(guò)低；因此，選用鎳柱對(duì)重組MBP-17N 進(jìn)行純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)收集到的蛋白或多或少都存在雜蛋白，推測(cè)可能是總蛋白中有類(lèi)似His 標(biāo)簽(多個(gè)組氨酸并列)結(jié)構(gòu)的非目的蛋白在純化過(guò)程中與Ni-NTA 結(jié)合[16-18]。鑒于此，BCA 法測(cè)定的蛋白濃度要大于實(shí)際獲得的目的蛋白濃度，相比之下，使用已知量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BSA)SDS-PAGE電泳確定目的蛋白會(huì)更可靠。