趙為民，曹靜，邢菲，王麗，任守文，付言峰，李碧俠，方曉敏*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014；4.江蘇農(nóng)科傳媒有限公司，江蘇 南京 210014；5.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

蛋白編碼基因的 3'端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)是指從終止密碼子到轉(zhuǎn)錄終止位點的這段區(qū)域。該區(qū)域雖然不編碼蛋白質(zhì)，但卻含有豐富的調(diào)控元件，以調(diào)控本身mRNA 的表達水平，從而豐富基因調(diào)控的多樣性與復雜性。如蛋白編碼基因3'UTR 含有microRNA 結(jié)合的種子序列，使microRNA 通過調(diào)節(jié)基因mRNA 的穩(wěn)定性來調(diào)控各種生理活動[1-3]。

Alu 是短散在核重復序列(SINEs)中最豐富的1 種重復元件，約占人基因組的10%，廣泛存在于靈長類生物基因的內(nèi)含子、5'和3'端非翻譯區(qū)(UTR)[4-5]。研究表明，Alu 元件在調(diào)控基因的選擇性剪接[5]、基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[6-7]、RNA 的A-to-I 編輯[5,8-10]中具有重要作用。此外，當?shù)鞍拙幋a基因的3'UTR 存在反向重復Alu(IRAlu)時，可導致該基因的mRNA 滯留于細胞核，而不能運出到細胞質(zhì)進行翻譯，從而實現(xiàn)對該基因蛋白水平的調(diào)控，進而影響細胞的各種生理活動[11-13]。

Alu 重復元件雖然特異存在于靈長類動物[14]，然而在小鼠和豬中已發(fā)現(xiàn)與Alu 元件相對應的B1、B2、B4 元件和PRE1 元件。有研究[15-16]表明，這些相對應元件的結(jié)構(gòu)和功能非常類似于靈長類動物的Alu。這說明存在于豬蛋白編碼基因3'UTR 中的IRPRE1 元件可能與IRAlu 具有類似調(diào)控基因的蛋白表達水平的功能。鑒于此，本研究中，對豬全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR 中的IRPRE1 重復元件進行鑒定，并對其對應基因的特征進行分析，旨在為研究這些含有IRPRE1 元件的蛋白編碼基因的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DH5a 感受態(tài)菌株購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。蘇紫豬組織樣品來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合動物實驗基地。采集3 頭健康成年母豬的心、肝、脾、肺、腎、小腸、背肌組織，投入液氮迅速冷凍，于-80 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒(Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT Master Mix)、DNA Marker 和pMD19-T 購于Takara；Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1×)購于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；DNA 純化回收試劑盒(DNA Clean & Concentrator)購于Zymo Research。

1.3 豬全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR 中IRPRE1 元件的分析

從Ensemble 網(wǎng)站的BioMart 中下載豬全基因組(Sscrofa11.1，Ensemble92)范圍內(nèi)的蛋白編碼基因的3'UTR 序列，整理成Fasta 格式。由于PRE1 元件屬于SINE/tRNA，使用RepeatMasker 在線網(wǎng)站對豬蛋白編碼基因3'UTR 序列先進行重復序列分析，篩選條件中search engine 為cross_match，DNA source為pig，挑選含有SINE/tRNA 元件的蛋白編碼基因；進一步選取SINE/tRNA 中含有Pre0_SS 和PRE1x (包括PRE1a、PRE1b、PRE1c、PRE1d、PRE1d2、PRE1e、PRE1f、PRE1f2、PRE1g、PRE1h、PRE1i、PRE1j、PRE1k)元件的蛋白編碼基因；再選擇Pre0_SS 和PRE1x 長度≥100 bp，且其中至少有1 對IR 的Pre0_SS 和PRE1x 元件為最終候選蛋白編碼基因。

1.4 GO 與KEGG 分析

采用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)對候選蛋白編碼基因進行GO(Gene Ontology)和KEGG pathway (Kyoto Ency- clopedia of Genes and Genomes)分析，選擇人的對應基因作為背景，研究這些蛋白編碼基因參與的生物學功能與途徑。篩選條件選擇Count 為2，EASE 為0.01，fold enrichment 不小于1.5。

1.5 候選蛋白編碼基因IRPRE1 元件的鑒定與組織表達

參照Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 說明書提取豬組織樣品的總RNA，并進行DNaseI 處理。參照PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄，對每個組織的1 μg總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄完后用滅菌水稀釋5倍，于-20 ℃保存。按照Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1×)說明書進行PCR，HPRT1基因為內(nèi)參基因，所有引物列于表1。引物合成與測序驗證均由南京擎科生物科技有限公司完成。對3 個蛋白編碼基因TRMO、RCSD1和DBT的3'UTR 中的IRPRE1 元件進行組織表達譜分析。由于選取的IRPRE1 元件位于3'UTR 且都是位于單個外顯子上，為了避免RNA 樣品中的DNA 污染，利用基因組上的引物(Genome)進行PCR 檢測，以檢測RNA 樣品中是否含有DNA。

表1 引物序列信息 Table 1 Primer sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 豬全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR 序列的重復元件

對Ensemble 網(wǎng)站中豬的全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因分析發(fā)現(xiàn)，一共有22 342 個蛋白編碼基因，對應45 788 個轉(zhuǎn)錄本。對45 788 個轉(zhuǎn)錄本的3'UTR 序列進行重復序列分析發(fā)現(xiàn)，其含有重復序列中的2 大類型，即分散重復序列與串聯(lián)重復序列。分散重復序列中的DNA 轉(zhuǎn)座子(DNA transposon)、長末端重復序列(LTR)、長散在重復序列(LINE)和短散在重復序列(SINE)分別占總數(shù)的7.31%、5.36%、14.87%和27.58%；串聯(lián)重復序列中的簡單重復序列 (simple_repeat)和低復雜度序列(low_complexity)分別占總數(shù)的31.08%和4.09%；其他種類重復序列占總數(shù)的9.71%。進一步發(fā)現(xiàn)SINE 與簡單重復序列種類的重復序列所占比例較高，其次為LINE，其余的都低于10%。

2.2 豬全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR 中SINE/tRNA 的種類

對豬的全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR中僅含有SINE/tRNA 的序列分析發(fā)現(xiàn)，其亞種類繁多，每個種類都占有一定的比例，而其中Pre0_SS和PRE1x 所占的比例分別為41.83%和37.51%(表2)，這2 類重復元件所占比例較高。

表2 豬全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR 中SINE/tRNA 的種類占比 Table 2 Analysis of SINE/tRNA type within 3'UTR sequences of genome-wide of protein-coding genes in porcine genome

2.3 豬全基因組范圍內(nèi)蛋白編碼基因3'UTR 含有IRPRE1 元件的鑒定結(jié)果

先去除豬全基因組范圍內(nèi)的22 342 個蛋白編碼基因3'UTR 中不含有SINE/tRNA 重復元件的基因，留下5 017 個蛋白編碼基因；再去除SINE/tRNA重復元件中不含Pre0_SS 與PRE1x 元件的基因，留下4 486 個蛋白編碼基因；然后去除Pre0_SS 與PRE1x 元件全部為同一方向、長度小于100 bp 的Pre0_SS 和PRE1x 的基因，最終得到1 094 個候選蛋白編碼基因，對應1 636 個轉(zhuǎn)錄本，進一步分析發(fā)現(xiàn)，這1 636 個轉(zhuǎn)錄本中PRE1 家族元件的長度為10～323 bp。如表3 所示，1 094 個蛋白編碼基因在豬不同染色體上的分布不同，其中Y 染色體上的最少，只有3 個。1～4 號和6 號染色體上的較多，其中6 號染色體的最多，達117 個。

表3 候選蛋白編碼基因在染色體上的分布 Table 3 The number distribution of candidate protein–coding genes on chromosomes

2.4 候選蛋白編碼基因的GO 分析結(jié)果

候選蛋白編碼基因一共參與38 個生物學過程，22 個細胞組分和15 個分子功能(P＜0.05)。以P值顯著性程度來衡量，生物過程、細胞組分和分子功能中排前十的注釋列于圖1。

圖1 候選蛋白編碼基因的GO 注釋 Fig.1 GO analysis of candidate protein–coding genes

2.5 候選蛋白編碼基因的KEGG pathway 分析結(jié)果

如表4 所示，以P值顯著性程度來衡量，候選蛋白編碼基因一共參與9 個生物學通路(P＜0.05)。

表4 KEGG 通路中基因相關(guān)信息 Table 4 Gene information involved in KEGG pathway

2.6 候選蛋白編碼基因IRPRE1 元件的鑒定與組織表達結(jié)果

圖2 為3 個蛋白編碼基因TRMO、RCSD1和DBT的3'UTR 中IRPRE1 元件方向示意圖。從圖3可知，陰性對照與DNaseI 消化后的各個組織RNA均檢測不到Genome擴增產(chǎn)物，而作為陽性對照的基因組DNA 中能檢測到Genome擴增產(chǎn)物，說明提取的組織RNA 中消除了DNA 的污染。從圖4 可知，TRMO、RCSD1和DBT中IRPRE1 元件在各個組織中都有不同程度的表達；TRMO基因的IRPRE1元件在心、肝、脾、肺、腎和肌肉中的表達較高，小腸中表達較弱；RCSD1基因的IRPRE1 元件在肌肉中表達較高，其他組織表達較弱，小腸中幾乎檢測不到；DBT基因的IRPRE1 元件在肌肉中表達較高，其他組織表達較弱，肺中幾乎檢測不到。

圖2 TRMO 和RCSD1 及DBT 基因的3'UTR 中IRPRE1 元件 Fig.2 A diagram of IRPRE1 elements of 3'UTR of TRMO,RCSD1 and DBT gene

圖3 RNA 樣品的DNA 污染檢測結(jié)果 Fig.3 DNA contamination detection for the RNA sample

圖4 候選蛋白編碼基因IRPRE1 元件的組織表達譜 Fig.4 Tissue expression profile of IRPRE1 element of candidate protein coding genes

3 結(jié)論與討論

Ensemble 數(shù)據(jù)庫對每個蛋白編碼基因有完善的注釋信息，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點、5'UTR 和3'UTR 的序列信息、cDNA 序列、CDS 序列等等，而且每隔一段時間就會發(fā)布一個新版本，非常有利于查詢，很多研究對基因的注釋信息都采用Ensemble[17-18]。NCBI 數(shù)據(jù)庫對蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)注釋信息，尤其是UTR 序列信息沒有Ensemble數(shù)據(jù)庫完善，且NCBI 數(shù)據(jù)庫與Ensemble 數(shù)據(jù)庫對基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量及UTR 的序列注釋差異也較大，目前對這種差異性還不能有效地驗證哪一個數(shù)據(jù)庫注釋的正確。在對Ensemble 數(shù)據(jù)庫中的蛋白編碼基因3'UTR 分析的同時，也查閱了相應NCBI 數(shù)據(jù)庫中的信息，發(fā)現(xiàn)存在很多差異，如在選取的3個基因TRMO、RCSD1、DBT中，RCSD1和DBT基因的3'UTR 序列在Ensemble 和NCBI 數(shù)據(jù)庫中一致，但TRMO 基因的3'UTR 序列的IRPRE1 元件序列在NCBI 的注釋中沒有，在Ensemble 的注釋中有，且試驗也驗證了TRMO基因3'UTR 序列的IRPRE1 元件的表達；因此，在本研究中采用了Ensemble 數(shù)據(jù)庫。

重復序列元件廣泛存在于哺乳動物基因組中，人的基因組中有將近一半的序列為重復元件[4]。LINE 和SINE 作為重復元件的主要類型，在基因的多樣性中發(fā)揮重要作用[14,19-20]。在豬的基因組序列中，LINE 和SINE 分別占17.5%和11.4%[16]。本研究中，LINE 和SINE 分別占3'UTR 總重復元件的14.87%和27.58%，且SINE 的占比僅僅稍低于簡單重復序列(31.08%)，表明SINE 相對于LINE 在3'UTR 序列可能發(fā)揮更加重要的調(diào)控作用。研究[16]表明，Pre0_SS 是非常相似于PRE1 的元件，故本研究中把Pre0_SS 元件也歸納到PRE1 元件家族中。本研究中，SINE/tRNA 中，Pre0_SS 和PRE1x 所占的比例分別為41.83%和37.51%，是SNINE/tRNA中最豐富的元件，這與對應人物種中Alu 元件占SINE 比例最高是一致的[4]。

Alu 元件的長度約為300 bp[21]，而PRE1 家族元件的長度約為250 bp[16]。本文研究中，PRE1 家族元件的長度為10～323 bp，說明有些蛋白編碼基因3'UTR 中的PRE1 元件的長度并不完整，有些只是PRE1 的部分序列。有研究[22-23]表明，IRAlu 中的2 個反向的Alu 元件長度大于100 bp 時才能形成有效的雙鏈RNA，從而發(fā)揮生物學功能，故本研究中對IRPRE1 元件的分析中也選取了蛋白編碼基因3'UTR 中長度大于100 bp 的PRE1。本研究中，IRPRE1 的2 個相反的PRE1 元件之間的間隔序列長度從幾十到上千個堿基，目前尚不清楚這種長度大小對IRPRE1 發(fā)揮的功能有何具體影響，且這種間隔長度大小變化也見于IRAlu 中[12]，需要后續(xù)進一步研究。

KEGG pathway 分析發(fā)現(xiàn)，有1 094 個蛋白編碼基因參與多種生物學通路，其中包括TNF 信號通路與RIG-I 樣受體信號等。TNF 與RIG-I 信號通路是響應細胞內(nèi)外信號的通路，可影響多種細胞的生理活動[24-25]，其相關(guān)基因的表達水平在上述通路中發(fā)揮重要功能，表明這些候選基因的IRPRE1 元件可能在調(diào)控其基因的表達水平中發(fā)揮著作用，進而影響基因本身在這些通路中的調(diào)控作用。