閆志強，陳春林，付文貴，鄭華，翟少欽

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

隨著養(yǎng)殖業(yè)向集約化迅速發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷增加，化學(xué)藥物大量使用或濫用及某些病毒性疾病(雞傳染性法氏囊病、雞馬立克氏病)感染等造成畜禽機體免疫功能下降，對疫苗免疫應(yīng)答減弱及各類疾病頻頻發(fā)生，最終導(dǎo)致畜禽生產(chǎn)性能降低[1-3]。基于此，本課題組通過臨床試驗，篩選出由女貞子(LIGUSTRI LUCIDI FRUCTUS)、黃芪(ASTRAGALI RADIX)、枸杞子(LYCII FRUCTUS)和菟絲子(CUSCUTAE SEMEN)組成的中藥復(fù)方，該復(fù)方可有效增強雛雞免疫功能，提高新城疫疫苗、法氏囊病疫苗抗體水平，促進(jìn)生長[4]。為臨床用藥方便，課題組通過優(yōu)化工藝，將其制備成顆粒劑。前期研究[5-6]表明，女黃顆粒對免疫抑制小鼠具有一定的調(diào)節(jié)作用，但其毒理學(xué)研究尚未知。為了更系統(tǒng)評價女黃顆粒的急性毒性及長期用藥的安全性，本研究中，依據(jù)《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中“獸藥急性毒性試驗指導(dǎo)原則”和“獸藥30 天和90 天喂養(yǎng)試驗指導(dǎo)原則”，進(jìn)行女黃顆粒對小鼠的急性毒性試驗和大鼠的亞慢性毒性試驗，對女黃顆粒的安全性進(jìn)行評價，旨在為其臨床用藥方案的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物

女黃顆粒由質(zhì)量比為4∶4∶1∶1 的女貞子、黃芪、枸杞子和菟絲子(均購自重慶榮昌區(qū)桐君閣大藥房)經(jīng)提取后濕法制粒而成，其規(guī)格為1.0 g 顆粒中含原生藥1.0 g，特女貞苷含量為1.46 mg/g。

1.1.2 試驗動物

SPF 級昆明小鼠80 只，體質(zhì)量18～20 g，雌、雄各半；SPF 級SD 大鼠80 只，體質(zhì)量70～90 g，雌、雄各半。供試動物均由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。試驗環(huán)境為屏障級，溫度22～24 ℃，相對濕度50%～60%。試驗前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由采食和飲水，灌胃前停食8 h，不限飲水。

1.1.3 主要儀器

PYX-DHS-60C×25-BS 型隔水式電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；Centrifuge 5340R型高速冷凍離心機(Eppendorf)；BC-6900 型血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；AU680 型生化分析儀(Beckman Coulter)；SUBAqua-12plus 型水浴鍋(Grant)；RM2235 輪轉(zhuǎn)切片機(德國徠卡)；CX31 型顯微鏡(OLYMPUS)；MP12001 型普通天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 急性毒性試驗

1.2.1 預(yù)試驗

40 只小鼠隨機分為16、4、1、0.5 g/kg 的劑量組及空白組，每組8 只，雌、雄各4 只。分籠飼養(yǎng)。小鼠禁食10 h 后，藥物組分別以16、4、1、0.5 g/kg的劑量灌胃給藥，空白組灌胃等體積的蒸餾水，各組小鼠的灌胃體積為每10 g 體質(zhì)量0.2 mL，給藥后禁食2 h，然后觀察7 d，記錄小鼠的表現(xiàn)及死亡情況。當(dāng)給藥劑量按體質(zhì)量計大于5 000 mg/kg 時小鼠沒有出現(xiàn)死亡，表明半數(shù)致死量(LD50)大于5 000 mg/kg，需進(jìn)行最大給藥量試驗[7]。

1.2.2 最大給藥量試驗

將女黃顆粒置研缽中研細(xì)，過孔徑180 μm 的網(wǎng)篩，加水溶解，以剛好通過16 號灌胃針的混懸液濃度為最大質(zhì)量濃度[8]，其值為1.125 g/mL。

40 只小鼠隨機分為女黃顆粒組和空白組2 組，每組20 只，雌雄各半。小鼠的最大灌胃體積為每次每10 g 體質(zhì)量0.4 mL，2 次/d，灌胃間隔6 h，女黃顆粒組用最大質(zhì)量濃度(1.125 g/mL)的女黃顆?；鞈乙汗辔福瞻捉M用蒸餾水灌胃，可計算出女黃顆粒組的灌胃劑量為90 g/kg。給藥后禁食2 h，然后觀察14 d，記錄小鼠的反應(yīng)及死亡情況。試驗結(jié)束時處死小鼠并解剖，觀察組織器官有無肉眼可見的病理變化。

1.3 亞慢性毒性試驗

1.3.1 試驗藥物制備

將女黃顆粒置研缽中研細(xì)，過孔徑180 μm 的網(wǎng)篩，用蒸餾水將藥粉調(diào)制成質(zhì)量濃度分別為0.9、0.3、0.1 g/mL 的藥液備用。

1.3.2 分組及處理

將80 只大鼠隨機分為女黃顆粒高、中、低劑量組(18、6、2 g/kg)及空白組，共4 組，每組20 只，雌、雄各10 只。藥物組分別以18、6、2 g/kg 的劑量灌胃給藥，空白組灌胃等體積的蒸餾水，每天定時灌胃，1 次/d，各組大鼠灌胃體積為每100 g 體質(zhì)量2.0 mL，連續(xù)灌胃30 d，給藥后禁食2 h[9]。

1.3.3 血液學(xué)和血液生化指標(biāo)的測定

末次給藥后禁食不禁水12 h，麻醉，眼眶采血，每只大鼠血樣分成抗凝血和促凝血，抗凝血用于血液學(xué)檢測，促凝血用于血液生化指標(biāo)檢測。血液學(xué)檢測內(nèi)容包括血紅蛋白(Hg)含量、紅細(xì)胞數(shù)(Ec)、白細(xì)胞數(shù)(Lc)和白細(xì)胞分類占比(嗜中性粒細(xì)胞(NL)、嗜酸性粒細(xì)胞(AL)、嗜堿性粒細(xì)胞(BL)、淋巴細(xì)胞(LM)和單核細(xì)胞(ML)在白細(xì)胞中占比)。血液生化指標(biāo)檢測內(nèi)容包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和尿素(BUN)、肌酐(Cr)、葡萄糖(Glu)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLO)含量。

1.3.4 大體解剖

試驗結(jié)束，采血后處死大鼠并解剖，肉眼觀察腎、肺、心、脾、肝、卵巢、睪丸等臟器的色澤、硬度、形態(tài)等有無異常。

1.3.5 臟器指數(shù)的測定

剖檢大鼠前稱體質(zhì)量，剖檢后對大鼠的主要臟器進(jìn)行分離，稱質(zhì)量，計算各個臟器的相對質(zhì)量，即臟器指數(shù)[10]。

1.3.6 組織病理學(xué)檢查

對高劑量組和空白組大鼠的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其具體方法為：用4%多聚甲醛固定組織樣本后進(jìn)行組織修塊，放入病理包脫水，包埋組織塊于石蠟中；將包埋好的組織切成5 μm 厚的薄片，脫蠟，HE 染色、封片；最后于顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化，采用顯微成像系統(tǒng)拍照，記錄組織學(xué)損傷情況[11-12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗結(jié)果

預(yù)試驗期間，各組小鼠灌胃給藥后精神正常，被毛整齊，食欲旺盛，糞便、尿液無異常；試驗結(jié)束時剖檢，發(fā)現(xiàn)試驗小鼠的肝臟、心臟、脾臟、胃、腸道、肺臟、腎臟、膀胱等均無腫大、出血、粘連等異常變化，未見任何肉眼可見的病理變化。試驗期間小鼠無死亡，無法測出其半數(shù)致死量。

最大給藥量試驗期間，試驗組小鼠精神狀態(tài)良好，被毛整齊，采食、飲水正常，糞便成形，無稀便、血便，尿液正常；試驗結(jié)束時剖檢，發(fā)現(xiàn)試驗小鼠的肝臟、心臟、脾臟、胃、腸道、肺臟、腎臟、膀胱等均無腫大、出血、黏連等異常變化，未見任何肉眼可見的病理變化；因此，女黃顆粒的最大給藥劑量為90 g/kg。

2.2 亞慢性毒性試驗結(jié)果

2.2.1 女黃顆粒對大鼠臨床表現(xiàn)的影響

在亞慢性毒性試驗期間，藥物組大鼠精神狀態(tài)正常，被毛整齊，食欲旺盛，未見異常行為，無死亡，表明女黃顆粒對大鼠臨床表現(xiàn)無不良影響。

2.2.2 女黃顆粒對大鼠體質(zhì)量的影響

由表1 可知，與空白組相比，女黃顆粒各劑量組雌性、雄性大鼠在給藥前和給藥7、14、21、30 d時的體質(zhì)量均無顯著變化(P＞0.05)，表明女黃顆粒對大鼠生長無不良影響。

表1 各組大鼠的體質(zhì)量 Table 1 Body weight of the studied rats

表1(續(xù))

2.2.3 女黃顆粒對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

由表2 可知，與空白組相比，給藥結(jié)束后，女黃顆粒組大鼠血液紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量及白細(xì)胞分類占比均無顯著性變化(P＞0.05)，且無量效關(guān)系；女黃顆粒中劑量組白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中占比有增長趨勢，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明女黃顆粒對大鼠血液學(xué)指標(biāo)無不良影響。

表2 各組大鼠的血液學(xué)指標(biāo) Table 2 Hematological indexes of the studied rats

2.2.4 女黃顆粒對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

由表3 可知，與空白組相比，女黃顆粒組大鼠血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和總蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素、肌酐、葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯含量均無顯著性變化(P＞0.05)，表明女黃顆粒對大鼠血液生化指標(biāo)無不良影響。

表3 各組大鼠的血液生化指標(biāo) Table 3 Blood biochemical indexes of the studied rats

2.2.5 女黃顆粒對大鼠大體解剖的影響

剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，各試驗組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸的形態(tài)、顏色、質(zhì)地均正常，無明顯肉眼可見病變。

2.2.6 女黃顆粒對大鼠主要臟器指數(shù)的影響

由表4 可知，與空白組相比，給藥后，大鼠的主要臟器(心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟)指數(shù)均無顯著性變化(P＞0.05)，說明女黃顆粒不會導(dǎo)致大鼠實質(zhì)臟器損傷或異常變化。

表4 各組大鼠的臟器指數(shù) Table 4 Organ indexes of the studied rats %

2.2.7 女黃顆粒對大鼠組織切片的影響

圖1 各組大鼠的主要臟器組織形態(tài) Fig.1 Main organ morphology of the studied rats

如圖1 所示，肝細(xì)胞呈輻射狀排列于中央靜脈周圍，肝細(xì)胞形態(tài)清晰，肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見 明顯組織病理損傷；脾靜脈竇、紅髓、白髓及淋巴小結(jié)組織結(jié)構(gòu)清晰，脾實質(zhì)無異常變化，未見明顯組織病理學(xué)損傷；胃黏膜層、黏膜下層和黏膜肌層 組織結(jié)構(gòu)清晰，未見異常變化；腎小球及各級腎小管組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密，腎單位結(jié)構(gòu)清晰未見明顯組織病理學(xué)變化；腸黏膜層、固有層黏膜下層等組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，未見明顯病理損傷；睪丸支持細(xì)胞及各級精母細(xì)胞與精子細(xì)胞形態(tài)完整，未見明顯病理損傷；卵巢鏡下見各級卵泡，卵泡組織結(jié)構(gòu)清晰完整，卵母細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等清晰可見，未見明顯病理損傷。

3 結(jié)論與討論

本研究中，在急性毒性試驗期間，試驗小鼠精神狀態(tài)良好，采食、飲水、二便均正常，無異常臨床表現(xiàn)，試驗小鼠無死亡；試驗結(jié)束時，剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠主要的臟器均無肉眼可見的病理變化；因此，未能測出女黃顆粒的LD50。依據(jù)毒理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)及藥物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為女黃顆粒無毒性。根據(jù)中國新獸藥研發(fā)規(guī)范與申報指南，對無法測出LD50的藥物需分析其最大給藥量[13]。本試驗以90 g/kg 的劑量灌胃給藥女黃顆粒，發(fā)現(xiàn)小鼠臨床表現(xiàn)正常，剖檢后發(fā)現(xiàn)其主要臟器無肉眼可見的病理變化，試驗期間小鼠無死亡，表明臨床合理使用女黃顆粒，對動物機體無急性毒性作用。

當(dāng)評價某受試藥物的毒性作用特點時，在了解受試藥物的理化性質(zhì)后，可進(jìn)行亞慢性毒性試驗，以提出較長期飼喂不同劑量的受試藥物對動物引起有害效應(yīng)的劑量、毒作用性質(zhì)和靶器官，估計亞慢性攝入的危險性，是新獸藥臨床前安全性評價的重要環(huán)節(jié)[14]。本研究中，主要從試驗動物的臨床表現(xiàn)，血液生理生化指標(biāo)及病理檢查3 個方面對女黃顆粒進(jìn)行亞慢性毒性評價。亞慢性毒性試驗期間，各組試驗大鼠精神狀態(tài)良好，被毛整齊，二便、采食、飲水與空白組相比均無異常；女黃顆粒組血液學(xué)各項指標(biāo)與空白組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但女黃顆粒中劑量組白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中占比有增長趨勢，這可能與女黃顆?？稍鰪姍C體免疫功能有關(guān)，與文獻(xiàn)[5]報道一致；女黃顆粒組血液生化各項指標(biāo)與空白組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；病理切片觀察無異常病理變化。

本試驗結(jié)果表明，女黃顆粒按照臨床推薦劑量使用，對受試動物無亞慢性毒性作用，有較高的安全性。