何莉娜，趙中權(quán)，黃思藝，喬 蕾，俄廣鑫

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716）

山羊是最古老的被馴化的動(dòng)物之一[1-3]，具有農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)、文化甚至宗教作用，是重要的肉產(chǎn)品資源[4]。大足黑山羊原產(chǎn)于重慶市大足區(qū)，是當(dāng)?shù)靥赜械娜庥煤谏窖蚱贩N，具有繁殖率高、肉質(zhì)好、耐粗飼適應(yīng)性強(qiáng)的特性[5]，2009 年列入國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄[6]。

目前多種分子遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳評(píng)估研究領(lǐng)域，如全基因組SNP[7-10]、線粒體DNA[11-14]、功能基因選擇[15-16]、微衛(wèi)星標(biāo)記[17-22]等。尤其是，微衛(wèi)星標(biāo)記的分布較廣、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳以及檢測(cè)迅速方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，故被廣泛用于群體遺傳多樣性研究。如Salamon 等[18]利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)評(píng)估了斑點(diǎn)豬有較高的遺傳多樣性。Bravo 等[19]利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)克里奧爾羊和西班牙綿羊的遺傳多樣性進(jìn)行了比較，證明了兩者遺傳距離很短。Hariyono 等[20]利用22 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了8 個(gè)印尼當(dāng)?shù)伉喨旱倪z傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Azimu 等[21]利用20 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析南疆8 個(gè)地方雞種的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)。Ee 等[22]采用20 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了云南8 個(gè)本地山羊品種的遺傳多樣性，為云南本地山羊品種的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。綜上可見(jiàn)，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用十分廣泛。本研究對(duì)重慶市大足區(qū)鐵山鎮(zhèn)大足黑山羊國(guó)家核心保種場(chǎng)內(nèi)的大足黑山羊資源群體進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估，為今后大足黑山羊品種改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大足黑山羊來(lái)自大足區(qū)鐵山鎮(zhèn)大足黑山羊國(guó)家核心保種場(chǎng)。參考系譜信息，利用系統(tǒng)內(nèi)隨機(jī)抽樣方法選擇55 個(gè)無(wú)親緣關(guān)系個(gè)體。用2%EDTA 抗凝管收集頸靜脈血2 mL，按照DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）的操作程序進(jìn)行全基因組DNA提取。

1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)分析 本研究參照聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）及國(guó)際遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）推薦，共篩選出19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)55 個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。引物信息見(jiàn)表1。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司進(jìn)行合成。

1.3 PCR 擴(kuò)增與基因分型 PCR 擴(kuò)增體系（15 μL）：Taq PCR Master Mix 7.5 μL，上、下 游 引 物 各0.5 μL（10 μmol/L），DNA 模 板0.5 μL（50～100 ng/μL），ddH2O 補(bǔ)至15 μL。

PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃ 5 min；變性 94℃ 30 s，退火 30 s（具體退火溫度見(jiàn)表1），延伸 72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 5 min；4℃保存。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI 3130 xl 全自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行檢測(cè)，分析參數(shù)設(shè)置參照儀器使用說(shuō)明書(shū)。Date collection V3.0 進(jìn)行熒光信號(hào)數(shù)據(jù)收集。收集到的熒光數(shù)據(jù)用GnenMapper v3.7 進(jìn)行基因型測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 觀測(cè)雜合度（Observed Heterozygosity，HO）、期望雜合度（Expected Heterozygosity，HE）、多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）、等位基因數(shù)（Number of Alleles，NA）利用Microsatellite Toolkit 軟件包進(jìn)行分析。群體近交系數(shù)（Fixation Indices of Subpopulation，F(xiàn)IS）利用Fstat 軟件包行分析。哈代溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Epuilibrium，HWE）利用Genepop 軟件進(jìn)行計(jì)算。群體瓶頸效應(yīng)（Bottleneck Effect）利用Bottleneck 軟件進(jìn)行分析。

表1 微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)結(jié)果 從位點(diǎn)水平來(lái)看，19 個(gè)位點(diǎn)在該群體中共發(fā)現(xiàn)178 個(gè)NA，其中在SRCRSP8 位點(diǎn)最多，有18 個(gè)，SRCRSP15 位點(diǎn)最少，為5 個(gè)。就整體而言，SRCRSP8 有最高的HE和PIC，分別為0.909 5 和0.892 9；ILSTS029 的HE和PIC 最低，為0.363 0 和0.343 8。由表2 可以看出，有16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)表現(xiàn)偏離哈代溫伯格平衡。

表2 19 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性分析結(jié)果

2.2 群體瓶頸效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果 在無(wú)限等位基因突變模型（Infinite Allele Mutation Model，IAM）、雙相突變模型（Two-Phase Mutation Model，TPM）和逐步突變模型（Step-Wise Mutation Model，SMM）假設(shè)下的Wilcoxon符號(hào)秩次檢驗(yàn)的結(jié)果如表3 所示。大足黑山羊群體在SMM 模型下（P=0.000 06）經(jīng)歷極顯著（P＜0.001）的瓶頸效應(yīng)；在IAM 模型和TPM 模型下均未經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)（P＞0.05）。Mode-shift 檢驗(yàn)結(jié)果顯示正常即符合標(biāo)準(zhǔn)的L-型分布（表3）。

表3 大足黑山羊群體遺傳瓶頸檢測(cè)結(jié)果

2.3 群體遺傳多樣性結(jié)果 群體上來(lái)看，大足黑山羊群體的HE為0.694 2，HO為0.570 3，平均PIC為0.655 8，F(xiàn)IS為0.180，3 個(gè)位點(diǎn)處于哈代溫伯格平衡（表4）。

表4 群體遺傳多樣性分析結(jié)果

3 討 論

3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)分析 就單個(gè)位點(diǎn)來(lái)看，所選的19 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中除了SRCRSP15、SRCRSP7、MAF209、ILSTS029和ILSTS005 位點(diǎn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），剩余位點(diǎn)PIC 均呈現(xiàn)高度多態(tài)性（PIC＞0.5）。整體結(jié)果表明該群體的遺傳多樣性豐富。根據(jù)哈代溫伯格平衡定律，在一個(gè)沒(méi)有選擇、突變、遺傳漂變以及隨機(jī)交配的大群體，基因頻率和基因型頻率是不會(huì)變的。該群體有16個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)偏離哈代溫伯格平衡，偏離個(gè)數(shù)較多。究其原因，大足黑山羊群體存在一定的人工選擇和近交，改變了群體的基因頻率，使得位點(diǎn)內(nèi)等位基因偏離哈代溫伯格平衡。

3.2 群體瓶頸效應(yīng)分析 本研究結(jié)果表明，大足黑山羊群體在SMM 模型下經(jīng)歷了遺傳瓶頸，這一現(xiàn)象必須引起足夠重視，選育是有目的、有計(jì)劃、高強(qiáng)度的人工定向選擇。一方面，選育群體的經(jīng)濟(jì)性狀（如生長(zhǎng)、體型等）得到了顯著改良；另一方面，高強(qiáng)度的人工選擇可能引發(fā)強(qiáng)烈的遺傳瓶頸效應(yīng)，增加近交衰退的可能性[23]，致使選育群體的生長(zhǎng)性能、繁殖性能以及抗逆或抗病性能下降，這在許多動(dòng)物（如牛[24-25]、豬[26]、靈長(zhǎng)類動(dòng)物[27]等）選育群體中曾經(jīng)發(fā)生過(guò)。因此，在今后的育種工作中應(yīng)該采取保留足夠的有效群體數(shù)量、擴(kuò)大繁育親本數(shù)量，從而避免或降低瓶頸效應(yīng)。

3.3 群體遺傳多樣性分析 群體上來(lái)看，大足黑山羊群體的HE為0.694 2，HO為0.570 3，雖然低于Dominguez 等[28]對(duì)墨西哥當(dāng)?shù)厣窖虻难芯拷Y(jié)果。但是本研究結(jié)果高于大部分山羊群體遺傳多樣性的研究結(jié)果，包括長(zhǎng)江沿岸中國(guó)山羊[12]、中國(guó)本地26 個(gè)山羊品種[29]以及中國(guó)克什米爾山羊[30]、意大利本土山羊[31]的研究結(jié)果。說(shuō)明大足黑山羊群體的遺傳多樣性比較豐富。

PIC 是反映基因豐富度的一項(xiàng)指標(biāo)，PIC 越高則表明群體遺傳基礎(chǔ)的多樣性越豐富。大足黑山羊群體的平均PIC為0.655 8，與巴巴里山羊的研究結(jié)果相當(dāng)[32]，高于長(zhǎng)江沿岸中國(guó)山羊品種[12]、26 個(gè)中國(guó)本地山羊品種[29]以及巴基斯坦山羊品種[33]的研究結(jié)果。說(shuō)明大足黑山羊群體的基因豐富度較高，遺傳多樣性豐富。

本研究表明，大足黑山羊FIS為0.180，3 個(gè)位點(diǎn)處于哈代溫伯格平衡。群體近交程度越高，表示越偏離哈代溫伯格平衡。偏高于大部分山羊種群遺傳多樣性的研究結(jié)果，包括墨西哥Pastore?a 山羊[28]（FIS=0.032）、中國(guó)云嶺黑山羊[12]（FIS=0.160）、中國(guó)濟(jì)寧灰山羊[29]（FIS=0.124）等。由此可見(jiàn)，大足黑山羊群體內(nèi)存在不同程度的近交。

4 結(jié) 論

本研究使用的19 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，可用作遺傳多樣性分析有效遺傳標(biāo)記。多態(tài)性最好的位點(diǎn)為SRCRSP8，為0.892 9；多態(tài)性最低的為ILSTS029，為0.343 8。群體內(nèi)HE高于HO，均大于0.5，表明該群體遺傳多樣性豐富。根據(jù)FIS和群體內(nèi)偏離哈代溫伯格平衡位點(diǎn)數(shù)來(lái)看，建議該大足黑山羊國(guó)家核心保種場(chǎng)相關(guān)工作人員進(jìn)一步加強(qiáng)保種工作，同時(shí)改變現(xiàn)有的保種模式和方案。