顧翰琦 劉冉 邵玲智 徐巖巖 王東巖 張冬梅 李潔

（河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)系，承德 067000）

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物已經(jīng)成為限制生物煉制產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題之一。木質(zhì)素衍生的酚類(lèi)化合物廣泛出現(xiàn)在不同預(yù)處理方式所得的水解物中，并表現(xiàn)出種類(lèi)復(fù)雜、毒性強(qiáng)和難去除的特性［1-3］。這類(lèi)抑制物可以分為：酚醛、酚酸和酚醇（酮），其對(duì)微生物的毒性依次減弱。雖然酚酸毒性弱于酚醛，但是預(yù)處理水解物中酚酸化合物的種類(lèi)和含量均高于酚醛和酚醇，且化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定。因此有必要深入分析這類(lèi)抑制物對(duì)典型的纖維素乙醇發(fā)酵微生物釀酒酵母生理特性的影響，并提出具有針對(duì)性的應(yīng)對(duì)策略。

目前，關(guān)于木質(zhì)素衍生酚類(lèi)化合物對(duì)釀酒酵母抑制作用機(jī)制尚不明確，且缺乏有效應(yīng)對(duì)措施。以往研究主要集中在酚醛和酚酸的抑制作用強(qiáng)弱比較［4-7］，而缺乏關(guān)于作用機(jī)制方面的深入研究。已有研究報(bào)道酚酸對(duì)細(xì)菌類(lèi)乳酸菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的細(xì)胞膜滲透性有影響，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降［8］。但是缺乏有效的應(yīng)對(duì)措施，酚酸物質(zhì)的水中溶解度低，通過(guò)常規(guī)水洗脫毒不能有效脫除，反而使其在木質(zhì)纖維素原料上富集［9］。另外，缺乏發(fā)酵微生物對(duì)酚酸耐受性相關(guān)的分子生物學(xué)背景信息，并不能夠通過(guò)理性的基因工程改造構(gòu)建耐受性菌株。

對(duì)微生物進(jìn)行馴化是一種應(yīng)對(duì)惡劣發(fā)酵環(huán)境的有效方法［10］。這種方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，在培養(yǎng)發(fā)酵種子液的過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行馴化能夠縮減操作步驟，降低木質(zhì)纖維素原料脫毒成本［11-12］。在惡劣環(huán)境正式發(fā)酵前，先將菌株置于低水平的壓力脅迫下進(jìn)行短期培養(yǎng)，使其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而在發(fā)酵初期能夠快速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。本研究擬通過(guò)短期馴化方式提高釀酒酵母對(duì)酚酸抑制物的耐受性，并初步探究酚酸耐受機(jī)制。以木質(zhì)素3種結(jié)構(gòu)單元對(duì)應(yīng)的香草酸、丁香酸和對(duì)羥基苯甲酸為酚酸模式化合物，分別考察酚酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)發(fā)酵的影響，比較不同策略馴化的菌株在酚酸環(huán)境中的生長(zhǎng)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，并從細(xì)胞膜完整性角度分析其酚酸耐受性原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑 香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司；其余化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑公司；酵母浸粉為生物試劑，購(gòu)自西寶生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和抑制劑 合成培養(yǎng)基（SM，g/L）：葡萄糖20、磷酸二氫鉀2、七水合硫酸鎂1、硫酸銨1和酵母浸粉10。單一酚酸抑制物母液（g/L）：香草酸母液60、對(duì)羥基苯甲酸母液100和丁香酸母液40?；旌戏铀嵋种莆锬敢海╣/L）：香草酸40、對(duì)羥基苯甲酸24和丁香酸20。3種酚酸的比例根據(jù)不同禾本植物木質(zhì)纖維素經(jīng)過(guò)不同類(lèi)型預(yù)處理方式產(chǎn)生的水解物中愈創(chuàng)木基、對(duì)羥基苯基和紫丁香基類(lèi)酚酸含量進(jìn)行設(shè)定［2-3，13］。上述酚酸抑制物母液中，二甲基亞砜（DMSO）作為助溶劑。母液按比例添加到SM中獲得設(shè)定的酚酸濃度，培養(yǎng)基中DMSO含量低于0.7%（V/V）。

1.2 方法

1.2.1 酚酸抑制物對(duì)釀酒酵母的影響 酵母菌株以10%接種量在SM中活化18 h（30℃、150 r/min），當(dāng)菌體密度在600 nm處吸光值（OD600）達(dá)到7-8，以10%接種量分別轉(zhuǎn)接到不同濃度的香草酸、對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸和混合酚酸培養(yǎng)基中，30oC，150r/min培養(yǎng)24 h。在設(shè)定時(shí)間取樣，10 000 r/min離心5 min，上清液用于液相色譜檢測(cè)，菌體沉淀用于測(cè)定生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 酚酸短期馴化策略對(duì)釀酒酵母耐受性的影響 策略A：活化的原始菌株以10%的接種量依次在抑制濃度（IC25，IC50和IC75）逐漸升高的混合酚酸培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)，每次在30oC，150 r/min培養(yǎng)12 h后以10%接種量轉(zhuǎn)接到下一個(gè)抑制濃度培養(yǎng)基中，最終獲得耐受性菌株。策略B：菌株在抑制濃度IC50保持不變的混合酚酸培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)4次。策略C：菌株依次在抑制濃度IC25，IC75，IC50和IC75脈沖變化的混合酚酸培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)。對(duì)照組：將活化后的酵母菌株以10%的接種量接種在不含抑制物的SM中轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次，其他培養(yǎng)條件同策略A。IC25、IC50、IC75和IC100分別代表能夠?qū)е略季晟L(zhǎng)抑制率為25%、50%、75%和100%時(shí)對(duì)應(yīng)的混合酚酸濃度（表1）。其中生長(zhǎng)抑制率是根據(jù)酵母菌株在不同酚酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h內(nèi)的最大比生長(zhǎng)速率計(jì)算所得。將上述菌株以10%的接種量分別轉(zhuǎn)接到能夠?qū)е陆湍干L(zhǎng)抑制率為75%的混合酚酸抑制濃度下30oC，150 r/min培養(yǎng)24 h，比較菌株在酚酸脅迫下的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。

1.2.3 分析方法 通過(guò)UV-VIS分光光度計(jì)（UV-752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定菌液在OD600吸光值分析菌體生長(zhǎng)。發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇濃度通過(guò)液相色譜（LC-20，日本島津公司）檢測(cè)：檢測(cè)器為RID-20A，色譜柱為Aminex-HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱溫箱溫度為65℃，流動(dòng)相為0.005 mol/L稀硫酸，流速為0.60 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL［14］。流式細(xì)胞儀檢測(cè)（FACSCaliburTM，美國(guó) BD Biosciences公司）［15］：酵母菌株在IC75的混合酚酸中培養(yǎng)9 h后進(jìn)行細(xì)胞收集，調(diào)整待測(cè)菌體濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/mL，用碘化丙啶（PI，10 μg/mL）的PBS（0.1 mol/L，pH7.4）溶液染色。上樣量1 mL，流速為2.0 mL/min，收集20 000個(gè)細(xì)胞，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)564-606 nm條件進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性和陰性對(duì)照為原始菌株在不含抑制物的SM中培養(yǎng)9 h后，收集細(xì)胞分別在沸水浴處理10 min和不處理。圖4中黑虛線是通過(guò)陽(yáng)性和陰性對(duì)照細(xì)胞數(shù)量標(biāo)記的PI染色和未染色細(xì)胞的界線，右側(cè)為被染色的細(xì)胞比例。

1.2.4 計(jì)算方法 酵母在不同酚酸抑制物培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性能由比生長(zhǎng)速率（μ）和菌體最大生物量（Biomass）表示。計(jì)算公式如下：μ=ln（xt/x0）/t，式中xt、x0分別為t和0時(shí)刻菌體濃度，單位g/L；t為菌體濃度x0到xt的間隔時(shí)間，單位h。釀酒酵母發(fā)酵性能分別由最大葡萄糖消耗速率（QGlu）和乙醇生產(chǎn)速率（QEth）表示，計(jì)算公式如下［9］：QGlu=（G0-Gt）/t；QEth=Eth/t，式中 G0和Gt分別是 0和 t時(shí)刻葡萄糖濃度，單位g/L；Eth是最大乙醇濃度，單位g/L；t為發(fā)酵時(shí)間，單位h。馴化菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能變化以Dx表示，Dx=（Xt-Xp）/Xp×100%，其中Xt和Xp分別代表馴化菌株和原始菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能各項(xiàng)指標(biāo)。

表1 混合酚酸培養(yǎng)基濃度

2 結(jié)果

2.1 酚酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

首先考察單一酚酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響。生長(zhǎng)方面，低濃度酚酸對(duì)酵母比生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯抑制，隨著濃度增加，生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)。得到香草酸、丁香酸和對(duì)羥基苯甲酸的最小致死濃度分別為3.03、3.82和5.04 g/L（圖1-A）。其中，由于丁香酸水中溶解度較低［16］，其濃度高于2.0 g/L對(duì)酵母產(chǎn)生的抑制作用未能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。而其最小致死濃度是參考已有研究報(bào)道的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)非線性擬合曲線向外延伸與x軸的交點(diǎn)推測(cè)所得［5］。發(fā)酵方面，糖耗速率和乙醇生產(chǎn)速率變化趨勢(shì)與生長(zhǎng)變化趨勢(shì)一致。雖然香草酸和對(duì)羥基苯甲酸對(duì)乙醇發(fā)酵速率有明顯抑制作用，但是并未影響乙醇最高濃度。而丁香酸在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)酵母的糖耗和乙醇發(fā)酵沒(méi)有明顯的抑制作用。（圖1-B-D）。

進(jìn)一步考察混合酚酸之間相互作用對(duì)酵母菌的協(xié)同抑制。隨混合酚酸濃度增加，菌體最大生物量和比生長(zhǎng)速率均受到明顯抑制，生長(zhǎng)延滯期由3 h延長(zhǎng)至24 h（圖2-A）。同時(shí)，糖耗速率和乙醇生產(chǎn)速率逐漸降低，乙醇最高濃度從8.33 g/L降低為0。當(dāng)混合酚酸中香草酸、對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸濃度分別為1.91、1.14和0.95 g/L時(shí)，在培養(yǎng)15 h內(nèi)酵母生長(zhǎng)收到完全抑制，發(fā)酵性能受到嚴(yán)重影響（圖2-B）。

2.2 短期馴化策略提高釀酒酵母的耐受性

通過(guò)不同馴化策略提高釀酒酵母對(duì)酚酸耐受能力，分別在馴化培養(yǎng)過(guò)程中逐漸提高（策略A）、保持恒定（策略B）和脈沖式提高（策略C）酚酸濃度。結(jié)果表明，在單獨(dú)和混合酚酸作用下，策略B馴化菌株的比生長(zhǎng)速率、最大生物量和乙醇生產(chǎn)速率均高于其他馴化菌株，其中比生長(zhǎng)速率的提高最顯著，可達(dá)70%以上。另外，對(duì)羥基苯甲酸作用下，策略C馴化菌株的葡萄糖消耗速率略高于其他馴化菌株，相比原始菌株提高了46.73%。馴化菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵性能均比原始菌株得到顯著提升，其中，策略B馴化菌株的比生長(zhǎng)速率、最大生物量和乙醇生產(chǎn)速率均高于其他馴化菌株，在生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵方面對(duì)酚酸均表現(xiàn)出良好的耐受性（圖3）。

2.3 酵母細(xì)胞膜完整性分析

細(xì)胞膜是發(fā)酵微生物對(duì)有害物質(zhì)的選擇性屏障，因此通過(guò)熒光探針對(duì)酚酸作用下酵母細(xì)胞膜完整性進(jìn)行檢測(cè)，分析其對(duì)酚酸耐受性的原因。碘化丙啶（PI）是一種熒光染料，能夠穿過(guò)破損的細(xì)胞膜與胞內(nèi)DNA結(jié)合形成能夠產(chǎn)生紅色熒光的復(fù)合物，從而標(biāo)記細(xì)胞膜受損細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明原始菌株（PS）和馴化策略培養(yǎng)過(guò)程的對(duì)照組菌株（Control）被PI染色的細(xì)胞率分別是28.8%和26.0%，明顯高于策略A、B和C馴化菌株，其中策略B馴化菌株P(guān)I染色細(xì)胞率最低，僅為10.8%（圖4），這與上述酚酸作用下生長(zhǎng)發(fā)酵性能的結(jié)果一致。

圖1 單一酚酸化合物對(duì)酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

圖2 混合酚酸化合物對(duì)酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的影響

3 討論

木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程中主要產(chǎn)生呋喃、弱酸和酚類(lèi)三大類(lèi)抑制物［17］，其中對(duì)于酚類(lèi)抑制物的研究主要集中于毒性較強(qiáng)的酚醛抑制物，而對(duì)于酚酸類(lèi)抑制物的作用機(jī)制和應(yīng)對(duì)措施并未徹底研究清楚。單一和混合酚酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的影響表明，單一酚酸在低濃度時(shí)，對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵沒(méi)有明顯的抑制作用；當(dāng)增加到一定濃度時(shí)，對(duì)比生長(zhǎng)速率、糖耗速率和乙醇生產(chǎn)速率有明顯的抑制作用，但對(duì)產(chǎn)生乙醇的最高濃度沒(méi)有影響。這與之前關(guān)于酚酸對(duì)其他微生物抑制作用的研究結(jié)果一致［7，9，13］。這可能因?yàn)榉铀嶂饕獙?duì)酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，而并不直接作用于乙醇發(fā)酵代謝路徑，從而表現(xiàn)出生長(zhǎng)速率下降進(jìn)而限制糖耗和乙醇生產(chǎn)速率。另外，本實(shí)驗(yàn)所選用酚酸的抑制作用順序?yàn)橄悴菟?丁香酸>對(duì)羥基苯甲酸，這可能與其官能團(tuán)類(lèi)型和位置有關(guān)［5］?；旌戏铀釋?duì)酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵抑制作用顯著增強(qiáng)，特別對(duì)發(fā)酵可達(dá)最高乙醇濃度有嚴(yán)重影響。這與相關(guān)研究報(bào)道的混合酚酸對(duì)其他種類(lèi)微生物的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用的結(jié)果相似［7，18］。

圖3 短期酚酸脅迫策略對(duì)酵母酚酸耐受性影響

圖4 酚酸對(duì)酵母細(xì)胞膜完整性影響

馴化策略在微生物育種構(gòu)建魯棒性工業(yè)發(fā)酵微生物方面是一種非常有效的方法［16，19-20］。短期馴化方法適合工業(yè)發(fā)酵實(shí)際應(yīng)用，將馴化過(guò)程整合到種子液培養(yǎng)過(guò)程同時(shí)完成，簡(jiǎn)化操作步驟。本實(shí)驗(yàn)比較不同短期馴化策略對(duì)釀酒酵母酚酸耐受性的影響。結(jié)果表明，馴化策略均能提高酵母菌株在單一和混合酚酸環(huán)境中的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能，特別是比生長(zhǎng)速率和葡萄糖消耗速率提高比較明顯。這與之前研究報(bào)道短期馴化提高酵母對(duì)高滲透壓和抑制物等惡劣條件耐受能力的結(jié)果類(lèi)似［21-22］。但是，短期馴化獲得的菌株所產(chǎn)生的酚酸耐受性表型，在撤去酚酸壓力脅迫后并不能在子代中穩(wěn)定遺傳（相關(guān)數(shù)據(jù)本文沒(méi)有列舉），因此推測(cè)短期馴化并未導(dǎo)致原始菌株產(chǎn)生相應(yīng)的基因突變。而酵母菌株產(chǎn)生酚酸耐受性提高現(xiàn)象的原因可能是短期酚酸壓力脅迫使酵母產(chǎn)生應(yīng)激作用，并形成了對(duì)酚酸應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄記憶，當(dāng)馴化后將其轉(zhuǎn)接到酚酸培養(yǎng)基中，在初始階段酵母細(xì)胞能夠很快表現(xiàn)出對(duì)酚酸耐受性狀［23-24］。另外，策略B馴化菌株在生長(zhǎng)和發(fā)酵方面均優(yōu)于其他馴化菌株，這可能與不同馴化過(guò)程中酚酸濃度變化情況有關(guān)。保持恒定酚酸濃度可能更容易使細(xì)胞產(chǎn)生表觀遺傳的轉(zhuǎn)錄記憶。

酚類(lèi)化合物因其具有較強(qiáng)的疏水性，能夠插入細(xì)胞膜脂質(zhì)分子層破壞細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［25］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，酚酸能夠破壞釀酒酵母的細(xì)胞膜完整性，這與其他酚類(lèi)化合物對(duì)微生物的破壞作用機(jī)制相同。經(jīng)過(guò)短期馴化策略能使酵母細(xì)胞膜在酚酸作用下能夠保持良好的完整性，從而提高對(duì)酚酸的耐受性。對(duì)于更為深入的耐受性機(jī)制分析，將在后續(xù)研究中通過(guò)透射電鏡直接觀察其結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，以及分析其細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的變化，從而揭示酵母細(xì)胞應(yīng)對(duì)酚酸的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的酚酸類(lèi)化合物對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)有抑制作用，從而導(dǎo)致乙醇發(fā)酵性能下降。多種酚酸混合后因彼此之間的相互作用會(huì)對(duì)酵母產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制作用；短期馴化策略能夠有效提高酵母菌株在混合酚酸脅迫下的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。馴化菌株酚酸耐受性的強(qiáng)弱與馴化過(guò)程中酚酸脅迫壓力水平變化方式有關(guān)；短期馴化提高酵母酚酸耐受性可能與細(xì)胞膜應(yīng)激反應(yīng)保持其完整性有關(guān)。后續(xù)將從細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)成分，以及相關(guān)基因等方面進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進(jìn)一步解釋其內(nèi)在作用機(jī)制。