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        牦牛CSRP3基因的克隆及組織表達(dá)分析

        2020-07-10 06:42:16白佳靈王會(huì)柴志欣王吉坤王嘉博武志娟信金偉鐘金城陳智華姬秋梅
        生物技術(shù)通報(bào) 2020年6期
        關(guān)鍵詞:牦牛結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)

        白佳靈 王會(huì) 柴志欣 王吉坤 王嘉博 武志娟信金偉 鐘金城 陳智華 姬秋梅

        (1. 西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041;2. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院,成都 610041;3. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,拉薩 850000)

        富含半胱氨酸蛋白(Cysteine and glycine-rich proteins,CRPs)基因家族是LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)超家族的一個(gè)分支,其特點(diǎn)是富含半胱氨酸和甘氨酸,包括CSRP1、CSRP2、CSRP3和TLP四個(gè)基因,CSRP3基因編碼的CRP3蛋白,又稱(chēng)MLP蛋白(Muscle LIM protein)或CLP蛋白(Cardiac LIM protein),主要在橫紋肌組織中表達(dá)[1]。CSRP3基因最早于大鼠的組織中獲得,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)人和大鼠的CSRP3基因均含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,起始密碼子位于第二外顯子,編碼194個(gè)氨基酸,主要是在心肌和骨骼肌中表達(dá),且其表達(dá)與肌分化過(guò)程一致,是一個(gè)肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子[2-4]。越來(lái)越多的研究表明,CRP3在肌源性分化和肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。CRP3蛋白可通過(guò)多種方式調(diào)控肌肉發(fā)育和肌肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持,同時(shí)也可作為機(jī)械傳感器蛋白,與許多細(xì)胞骨架蛋白相互作用,參與基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架組裝[5-7];或通過(guò)其 LIM結(jié)構(gòu)域在自噬過(guò)程中與LC3(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)相互作用,促進(jìn)細(xì)胞自噬[8];或與心肌肌球蛋白MyBP-C結(jié)合形成CRP3/MyBP-C復(fù)合物,參與肌纖維形成過(guò)程,并通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白ATP酶活性,在成肌細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[9]。

        研究發(fā)現(xiàn)CSRP3基因不僅對(duì)人類(lèi)疾病有一定影響,對(duì)畜禽肉質(zhì)及其生長(zhǎng)性能方面也有重要影響。已有研究表明,CSRP3基因突變會(huì)導(dǎo)致人肥厚性心肌?。?0]。敲除小鼠CSRP3基因也會(huì)導(dǎo)致心肌肥大和心衰[6]。CSRP3基因缺陷小鼠的骨骼肌的肌小節(jié)與肌纖維長(zhǎng)度都比正常小鼠短,表明CRP3在維護(hù)正常的肌肉結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用[3]。對(duì)豬CSRP3基因進(jìn)行克隆及鑒定表明CSRP3基因是影響豬肉品質(zhì)的潛在功能候選基因[11]。干擾CSRP3 mRNA的表達(dá)會(huì)抑制雞的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞向肌管分化,表明CSRP3可能會(huì)通過(guò)促進(jìn)雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化從而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[12]。對(duì)秦川牛CSRP3基因進(jìn)行SNP分析發(fā)現(xiàn),群體中某些組合基因型與生長(zhǎng)和胴體性狀顯著或極顯著相關(guān),證明CSRP3作為一種標(biāo)記基因在提高生長(zhǎng)性能和胴體性狀方面有著巨大潛力[13]。研究發(fā)現(xiàn)CSRP3在小尾寒羊心臟組織中的表達(dá)量顯著高于杜泊羊,而在肌肉(背長(zhǎng)肌和股二頭肌)組織中則相反[1]。

        牦牛(Bos grunniens)是以我國(guó)青藏高原為起源地的大型反芻動(dòng)物,也是“世界屋脊”著名的景觀牛種,素有“高原之舟”的美稱(chēng),是一個(gè)極其難得的、寶貴的基因庫(kù)[14-15]。牦牛肉品質(zhì)好、口感好,是無(wú)污染的綠色食品,符合高蛋白、低脂肪的現(xiàn)代人健康飲食要求[16],研究肌肉發(fā)育調(diào)控的相關(guān)基因?qū)μ岣哧笈H馄焚|(zhì)具有重要意義,已有研究[1,11-13]發(fā)現(xiàn)CSRP3基因參與調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育過(guò)程,對(duì)畜禽生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì)具有重要影響,而關(guān)于牦牛CSRP3基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)牦牛CSRP3基因進(jìn)行克隆及組織表達(dá)譜分析,以期為后續(xù)提高牦牛肉品質(zhì)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        實(shí)驗(yàn)樣品采集于西藏自治區(qū)昌都市類(lèi)烏齊縣,選取3頭0.5歲健康類(lèi)烏齊牦牛,分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀大肌和臀脂,用DEPC水清洗干凈后,包裹于錫箔紙中并做好標(biāo)記,迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

        主要試劑:Taq DNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自博邁德生物公司;RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRTReagent Kit with gDNA Eraser[Perfect Real Time])、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2 000 bp DNA Marker、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均購(gòu)自 TaKaRa 公司;瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 使用TRIzol法提取組織總RNA,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及OD260nm/280nm值。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,存于-20℃冰箱備用。

        1.2.2 牦牛CSRP3基因的克隆 根據(jù)GenBank中野牦牛CSRP3mRNA序列(XM_005900673.2),內(nèi)參基因GAPDH(XM_014482068),利用Primer Premier 5軟件和NCBI Primer-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CSRP3基因CDS區(qū),再用克隆所得CSRP3基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1),引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

        PCR擴(kuò)增體系(總體積為25 μL):上下游引物各 1 μL、cDNA 模 板 1 μL、ddH2O 9.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性 30 s,65℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,循環(huán)35次,72℃延伸7 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行膠回收。

        將純化回收得到的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體,并置于16℃恒溫的金屬浴中過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒,進(jìn)行菌液PCR鑒定,并將篩選出來(lái)的菌液送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

        表1 牦牛CSRP3基因引物序列信息

        1.2.3 組織表達(dá)差異分析 根據(jù)測(cè)序得到的序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,檢測(cè)CSRP3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀達(dá)肌和臀脂組織的表達(dá)量。反應(yīng)體系(10 μL):TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL、上下游引物各0.4 μL、無(wú)菌去離子水3.2 μL、模板cDNA 1 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,55℃退火30 s,共39個(gè)循環(huán)。其中每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù),獲得每個(gè)樣品的Ct值后,采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)颖径拷Y(jié)果進(jìn)行處理。利用SPSS 20.0軟件對(duì)CSRP3基因在不同組織器官中的差異進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異顯著。

        1.2.4 生物信息學(xué)分析 對(duì)牦牛CSRP3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用DNAStar中的MegAlign軟件對(duì)牦牛與其他12個(gè)物種的CSRP3基因CDS區(qū)序列做同源性分析,使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),其他所用到的在線軟件如表2所示。

        表2 生物信息學(xué)分析在線軟件網(wǎng)址

        2 結(jié)果

        2.1 牦牛CSRP3基因CDS區(qū)擴(kuò)增及克隆測(cè)序

        CSRP3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得與預(yù)期牦牛CSRP3基因片段大小一致的單一清晰條帶,大小為673 bp(圖1),測(cè)序驗(yàn)證后得到牦牛CSRP3基因CDS區(qū)大小為585 bp,編碼194個(gè)氨基酸殘基,相關(guān)序列信息已提交NCBI,登錄號(hào)為MN695918。

        圖1 牦牛CSRP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

        2.2 牦牛CSRP3基因序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

        利用MegAlign軟件將克隆得到的牦牛CSRP3基因序列與家貓、斑馬魚(yú)、褐家鼠、黃牛、家雞、獼猴、黑猩猩、野豬、家犬、綿羊、熱帶爪蟾、蘇門(mén)答臘猩猩的該基因序列進(jìn)行相似性比對(duì),其中牦牛與黃牛的序列相似性高達(dá)100%,與斑馬魚(yú)的序列相似性為75.0%(表3)。利用MEGA 7.0 軟件采用NJ聚類(lèi)法構(gòu)建牦牛CSRP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2),結(jié)果顯示牦牛與黃牛的親緣性最近;其次是綿羊;而與斑馬魚(yú)和熱帶爪蟾等較低等脊椎動(dòng)物相距最遠(yuǎn)。

        2.3 CRP3蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

        利用在線軟件ExPASy中的ProtParam程序預(yù)測(cè)CRP3蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果表明:該蛋白的分子式為C903H1403N263O275S19,由2 863個(gè)原子組成,分子質(zhì)量為20 952.81,氨基酸總數(shù)為194,含量最多的是甘氨酸(13.4%);其次是賴(lài)氨酸和半胱氨酸(10.3%和8.2%);帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu)為17,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為27,說(shuō)明該蛋白帶正電荷;總平均親水性(GRAVY)為-0.561,為親水性蛋白;理論等電點(diǎn)為8.89,為偏堿性蛋白;摩爾消光系數(shù)為23 920,在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h,不穩(wěn)定指數(shù)為40.16,脂肪指數(shù)為43.81,根據(jù)Guruprasad方法表明CRP3為不穩(wěn)定蛋白。

        利用在線軟件ExPASy中的ProtScale程序預(yù)測(cè)CRP3蛋白的親水性/疏水性(圖3),147位點(diǎn)處有最大值為1.222,97位點(diǎn)處有最小值為-2.256,故CRP3蛋白變現(xiàn)為親水性,與理化性質(zhì)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

        表3 牦牛與其它12個(gè)物種CSRP3基因序列相似性比對(duì)

        圖2 NJ法構(gòu)建的牦牛CSRP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

        2.4 CRP3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與信號(hào)肽分析

        通過(guò)在線軟件ExPASy 中TMpred程序預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),CRP3蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(圖4),不屬于跨膜蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析,發(fā)現(xiàn)無(wú)信號(hào)肽,說(shuō)明CRP3蛋白不屬于分泌蛋白。

        圖3 牦牛CRP3蛋白的親水性/疏水性分析

        圖4 牦牛CRP3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

        2.5 CRP3蛋白磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

        通過(guò)在線軟件NetPhos 3.1 Server,對(duì)CRP3蛋白序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果(圖5)顯示在牦牛CSRP3基因編碼的氨基酸中有12個(gè)絲氨酸(S)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸(T)磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn)。利用NetNGlyc 1.0 對(duì)其進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果(圖6)顯示CRP3有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(Asn107和Asn158),7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(Thr95、Thr101、Thr103、Thr104、Thr105、Thr106和Thr109)。

        圖5 牦牛CRP3蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

        圖6 牦牛CRP3蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

        2.6 CRP3蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位分析

        利 用NCBI中 的Conserved Domain Database(CDD)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CRP3蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果(圖7)顯示該蛋白為L(zhǎng)IM蛋白超家族成員,在第9-61位之間和第119-171位之間存在兩個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域,LIM結(jié)構(gòu)域存在于多個(gè)發(fā)育途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子中,兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有8個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。

        利用在線軟件PSORT II Prediction分析牦牛CRP3蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),該蛋白在細(xì)胞核內(nèi)分布最多(78.3%);其次為細(xì)胞質(zhì)(17.4%),線粒體中也有少量分布(4.3%)。

        圖7 牦牛CRP3蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

        2.7 CRP3蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        使用在線軟件ExPASy 中的SOPMA程序預(yù)測(cè)牦牛CRP3的二級(jí)結(jié)構(gòu),分析結(jié)果顯示,該蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主,其中α-螺旋18個(gè)占總鏈的9.28%,延伸鏈28個(gè)占總鏈的14.43%,β-轉(zhuǎn)角10個(gè)占總鏈的5.15%,無(wú)規(guī)則卷曲138個(gè)占總鏈的71.13%(圖 8)。

        圖8 牦牛CRP3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

        利用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)牦牛CRP3蛋白進(jìn)行同源模建,預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,其最佳模型是1b8t.1.A(圖9),序列一致性為67.43%;另一模型是2xjy.1.A,序列一致性為21.43%。該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)表明,他們組成的多肽鏈有兩個(gè)高度相似的LIM結(jié)構(gòu)域。

        圖9 牦牛CRP3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

        2.8 牦牛CSRP3基因組織表達(dá)分析

        通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CSRP3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀大肌和臀脂組織的表達(dá)量,并用SPSS 20.0軟件對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示,CSRP3基因在心臟表達(dá)量最高,并極顯著高于其他組織(P<0.01);其次是臀大肌,在肝臟中的表達(dá)量最低(圖10)。

        3 討論

        研究表明CSRP3基因能夠參與調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育,其編碼的CRP3蛋白可以通過(guò)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用在肌肉發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)CSRP3基因在豬[11]、綿羊[1]、黃牛[13]、雞[12]等畜禽的肌肉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,說(shuō)明該基因?qū)π笄萆L(zhǎng)性能和產(chǎn)肉品質(zhì)具有重要影響。但關(guān)于牦牛CSRP3基因的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道,而被譽(yù)為“高原之舟”的牦牛,其肉質(zhì)在很大程度上能決定其價(jià)值,因此對(duì)牦牛CSRP3基因的研究具有重要意義。本研究成功克隆了CSRP3基因的CDS區(qū)序列并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)其在牦牛不同組織中的表達(dá)量。

        圖10 牦牛CSRP3基因的mRNA的組織表達(dá)分析

        對(duì)克隆得到的牦牛CSRP3基因序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因CDS區(qū)序列長(zhǎng)585 bp,編碼194個(gè)氨基酸。甘氨酸具有獨(dú)特的甜味,是形成肉品香味所必需的前體氨基酸,與肉質(zhì)的鮮味有直接的關(guān)系,同一種食物鮮味氨基酸含量越高,滋味就越好[17]。賴(lài)氨酸作為必需氨基酸可以合成骨骼肌等多種蛋白,抑制部分肌纖維蛋白質(zhì)降解,賴(lài)氨酸殘基是骨膠原交聯(lián)的主要構(gòu)成物質(zhì),羥賴(lài)氨酸參與膠原蛋白的糖基化修飾,而膠原蛋白和鈣磷等礦物質(zhì)是構(gòu)成骨骼的主要成分,因此賴(lài)氨酸對(duì)骨骼代謝有重要影響[18]。半胱氨酸可以通過(guò)促進(jìn)谷胱甘肽的合成來(lái)提高反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[19]。本研究顯示牦牛CRP3蛋白甘氨酸、賴(lài)氨酸和半胱氨酸的含量分別為13.4%、10.3%和8.2%,表明牦牛CSRP3基因?qū)∪獍l(fā)育過(guò)程有一定調(diào)控作用并可能會(huì)影響其肉質(zhì)和生長(zhǎng)性能。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu)小于帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys),故CSRP3基因編碼的蛋白質(zhì)帶正電荷,該蛋白理論等電點(diǎn)為8.89,是偏堿性蛋白,其不穩(wěn)定指數(shù)為40.16,是不穩(wěn)定蛋白,對(duì)其親水性/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白為親水性蛋白。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,CSRP3基因編碼的蛋白含有22個(gè)磷酸化位點(diǎn),2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。磷酸化是一種廣泛存在的重要的翻譯后蛋白質(zhì)修飾作用,蛋白質(zhì)磷酸化作用為調(diào)控蛋白質(zhì)合成和代謝,分子識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo),肌肉收縮等,糖基化屬于蛋白修飾,其作用是維持蛋白的空間構(gòu)象,調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體的表達(dá)和功能,影響細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡[20]。牦牛CRP3蛋白主要分布在細(xì)胞核中,線粒體和細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布。有關(guān)研究表明[21],在細(xì)胞核中,CRP3是肌生成的正向調(diào)控因子,促進(jìn)肌源性分化,CRP3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肌管分化增強(qiáng),這是由于CRP3與MyoD、肌原蛋白、MRF4等肌分化轉(zhuǎn)錄因子直接相關(guān);在細(xì)胞質(zhì)中突變或缺乏CRP3會(huì)造成心臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞和肌纖維的紊亂,這種細(xì)胞骨架效應(yīng)主要是通過(guò)其在z盤(pán)上的定位及其與不同z盤(pán)組件的相互作用介導(dǎo)的,說(shuō)明CRP3蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可發(fā)揮作用。

        CSRP3基因所屬的CRPs基因家族是LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)超家族的一個(gè)分支,該家族成員含有的典型結(jié)構(gòu)域?yàn)長(zhǎng)IM結(jié)構(gòu)域,對(duì)CRP3蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,其含有兩個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域,與CRP3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。LIM結(jié)構(gòu)域廣泛存在于真核生物蛋白中,LIM由兩個(gè)不同的鋅指亞結(jié)構(gòu)域組成,其結(jié)構(gòu)高度保守,主要與蛋白質(zhì)結(jié)合,可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架的形成中發(fā)揮重要作用。含有LIM結(jié)構(gòu)域的CRP蛋白亞家族與細(xì)胞骨架相關(guān),在黏附斑塊和肌動(dòng)蛋白微絲組織中具有作用,參與細(xì)胞骨架的重建和平滑肌的分化[22]。

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,牦牛CSRP3基因主要在心臟中表達(dá);其次是臀大肌。與He[13]發(fā)現(xiàn)CSRP3基因在黃牛肌肉中表達(dá)量最高;其次是心臟的研究結(jié)果存在差異。這種差異表達(dá)可能是因?yàn)镃SRP3基因在牦牛和黃牛肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中的調(diào)控機(jī)制存在差異;也可能是所選取的發(fā)育階段不同造成的;另外也可能與牦牛生活在高海拔低氧地區(qū),心臟在高原低氧適應(yīng)中扮演重要角色有關(guān)[23],具體原因需要進(jìn)一步研究。CRP3蛋白在心肌細(xì)胞和慢收縮骨骼肌細(xì)胞中均有表達(dá)[24],研究發(fā)現(xiàn)CRP3是一種參與心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),siRNA沉默CSRP3基因之后,可使由苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和CSRP3過(guò)表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn),說(shuō)明CSRP3基因在心臟保護(hù)方面能夠發(fā)揮重要作用[10]。CRP3蛋白在大鼠慢肌中組成性的表達(dá),在快肌中低表達(dá),并在快型骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)換為慢型骨骼肌蛋白過(guò)程中上調(diào)表達(dá)[25]。Vafiadaki等[26]發(fā)現(xiàn)了 CRP3 蛋白的剪接變異體(CRP3-b),CRP3-b定位于分化橫紋肌的肌節(jié),可直接與z盤(pán)成分結(jié)合,作為肌管形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子參與肌發(fā)生過(guò)程。綜上所述,前人研究結(jié)果均表明CSRP3基因是心臟和骨骼肌功能的主要調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果表明CRP3在牦牛臀大肌中具有較高表達(dá)量,推測(cè)該基因在牦牛肉品質(zhì)的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

        4 結(jié)論

        本研究成功克隆了牦牛CSRP3基因,得到長(zhǎng)為585 bp的CDS區(qū)序列,編碼194個(gè)氨基酸殘基;生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,CRP3蛋白含有兩個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域,主要分布在細(xì)胞核中,可正向調(diào)控肌肉發(fā)育過(guò)程;實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有較高表達(dá)量。以上研究結(jié)果為牦牛CSRP3基因在牦牛肉品質(zhì)方面的調(diào)控機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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