牛歡 馮靜云 黃建國(guó) 張超群 張露露 劉曉穎 王振英

（1. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2. 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上廣泛種植的禾本科糧食作物之一，但各種病蟲害的發(fā)生嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量，其中由布氏白粉菌（Blumeriagraminisf. sp.tritici）引起的小麥白粉病是危害嚴(yán)重的病害之一［1-2］。

Sec14p是一種廣泛存在于真核生物中的磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Phosphatidylinositol transfer proteins，PITPs）［3］，最早在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被發(fā)現(xiàn)［4］，主要參與磷脂代謝和形成高爾基體分泌囊泡等過程［5-6］。最近發(fā)現(xiàn)，Sec14基因家族在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮了重要的作用，Wang等［7］在擬南芥中過表達(dá)玉米Sec14p基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)變短、種子萌發(fā)率下降，并且脯氨酸的積累減少，抗氧化酶活性下降，這一系列變化最終提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受性。Kie?bowicz-Matuk等［8］在抗旱大麥中發(fā)現(xiàn)，HvSec14p蛋白能與大多數(shù)磷脂酰肌醇結(jié)合，且在滲透脅迫下轉(zhuǎn)錄水平明顯增加。認(rèn)為該蛋白可能通過參與細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的合成，增強(qiáng)抗旱大麥細(xì)胞膜的滲透能力。毛花英等［9］在甘蔗中克隆了Sec14基因，發(fā)現(xiàn)在聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、鹽、CaCl2和水楊酸（Salicylic acid，SA）脅迫下ScSec14基因表達(dá)均上調(diào)，推測(cè)ScSec14可能參與了Ca2+和SA介導(dǎo)的信號(hào)通路從而響應(yīng)逆境脅迫。蘇世超等［10］發(fā)現(xiàn)TaSec14p-5基因在小麥孕穗期的不同組織中組成型表達(dá)，并受鹽、脫落酸（Abscisic acid，ABA）、干旱及低溫脅迫的誘導(dǎo)。有關(guān)Sec14基因參與植物與病原菌互作的研究?jī)H在煙草（Nicotiana tabacumL.）中有過報(bào)道，Kiba等［11］發(fā)現(xiàn)煙草被青枯菌（Ralstonia solanacearum）侵染后，NbSec14基因的表達(dá)上調(diào)，而沉默NbSec14后煙草對(duì)青枯菌的抗性降低，推測(cè)該基因可能與植物防御反應(yīng)有關(guān)。在隨后的研究中還發(fā)現(xiàn)，NbSEC14基因沉默植株中二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）、磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）的含量下降，磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）的活性降低；過表達(dá)NbSEC14植株的DAG、PA含量上升，PLC、PLD活性升高。認(rèn)為NbSEC14蛋白可能通過參與磷脂代謝、調(diào)節(jié)磷脂酶活性，從而在煙草抗青枯菌的免疫反應(yīng)中起重要作用［12］。目前，還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于Sec14基因參與小麥與白粉菌互作過程的報(bào)道。

通過RNA-seq技術(shù)得到感病小麥品種京411中一段差異表達(dá)序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物克隆了TaSec14基因。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析TaSec14的基因結(jié)構(gòu)和與其他物種Sec14的同源性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和VIGS技術(shù)分別分析TaSec14基因在不同抗性品種小麥接種白粉菌后的表達(dá)模式，以及降低該基因表達(dá)后感病小麥京411的抗病性變化，從而探究TaSec14基因在小麥與白粉菌互作過程中的作用，并為研究TaSec14基因功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

京411是半矮稈小麥品種，具有抗寒性強(qiáng)、分蘗力強(qiáng)、成穗率高等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)北部冬麥區(qū)高產(chǎn)廣適育種的骨干親本［13］，苗期對(duì)白粉菌侵染的表型為高感［14］。Brock是對(duì)白粉病具有強(qiáng)抗性的小麥品種，作為抗病遺傳資源從英國(guó)引進(jìn)，可能攜帶Pm2基因［15-16］。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究發(fā)現(xiàn)，Brock的Pm2可能已經(jīng)喪失了對(duì)白粉病病原菌的抗性，在Brock小麥的3BL上可能攜帶一個(gè)新的抗白粉病基因［17］。京 411×Brock抗白粉病近等基因系 BJ-1，該材料是以感病品種小麥京411為輪回親本，以抗病品種小麥Brock為抗病基因供體，通過雜交獲得F1代。之后再與感病品種小麥京411進(jìn)行連續(xù)回交6代，每一代都在白粉菌脅迫下選取抗病植株，最后再自交1代后獲得［18］。所用菌種為白粉菌生理小種E09，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。病毒材料為大麥條紋花葉病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）。

實(shí)驗(yàn)所用引物見表1，由金唯智生物科技有限公司天津分公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片cDNA和DNA的制備 根據(jù)Promega 公 司 Eastep?Super Total RNA Extraction Kit中的方法提取京411品種小麥葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性，Nanodrop1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。按照Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase中體系以oligo（dT）18作為反轉(zhuǎn)錄引物，京411品種小麥總RNA為模板合成cDNA。使用天根公司Plant Genomic DNA Kit中的方法提取京411小麥基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品完整性。

1.2.2TaSec14基因的克隆及序列分析 根據(jù)RNASeq結(jié)果設(shè)計(jì)引物SecCDS-F/R，以京411小麥cDNA為模板，擴(kuò)增差異表達(dá)序列。體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，SecCDS-F 0.5 μL，SecCDS-R 0.5 μL，cDNA 0.25 μL，Prime STAR GXL 0.5 μL，滅菌水 15.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?：94℃ 5 min ；35 個(gè)循環(huán) ：98℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 1 min 15 s；68℃ 7 min；4℃保存?；厥漳康幕虿⒑蚿GEM-TEasy構(gòu)建重組載體后送公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI中的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved domain database，CDD）分析其結(jié)構(gòu)域。將基因序列上傳至NCBI GeneBank進(jìn)行Blastx比對(duì)，查找與其相似度高的基因。再利用DNAMAN軟件將該基因的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其同源性。

根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)DNA擴(kuò)增引物SecFlth-F/R，以京411的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，SecFlth-F 0.5μL，SecFlth-R 0.5 μL，DNA 1 μL，Prime STAR GXL 0.5 μL，滅菌水 15.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；35個(gè)循環(huán) ：98℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 2 min ；68℃ 7 min；4℃保存。按照與cDNA相同的方式測(cè)得目的基因的DNA序列，并用IBS 1.0.2軟件繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。

1.2.3TaSec14基因在白粉菌脅迫下的表達(dá)模式分析 京411、BJ-1和Brock幼苗長(zhǎng)至一葉一心期時(shí)，采用抖佛法將新鮮的白粉菌孢子均勻接種于小麥第一葉表面。分別對(duì)接種不同時(shí)間點(diǎn)（0、2、4、8、12、24和48 h）的不同品種小麥第一葉進(jìn)行取材，剪取葉尖1/3部位3 cm，放于滅菌且經(jīng)液氮低溫處理過的2 mL EP管中，-80℃超低溫冰箱保存。按照1.2.1中的方法獲得小麥cDNA，并根據(jù)cDNA非保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物SecQ-F/R，以小麥TaActin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)上海羅氏制藥有限公司Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 1 μL，SecQ-F 1 μL，SecQ-R 1 μL，無菌水 7 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?0℃ 2 min；40 個(gè)循環(huán) ：95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s。反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析，以確定引物的特異性。將樣品擴(kuò)增的Ct值進(jìn)行匯總，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，將3個(gè)重復(fù)得到的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)計(jì)算平均值作為最終結(jié)果，并用Origin 9軟件繪制TaSec14基因的相對(duì)表達(dá)量圖。

1.2.4TaSec14基因的VIGS分析 根據(jù)TaSec14基因非保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性沉默引物 SecV-F/R，以感病小麥京411的cDNA為模板擴(kuò)增沉默片段。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，回收沉默片段后與BSMVγ∶載體骨架構(gòu)建重組載體BSMVγ∶TaSec14。

提取含有病毒載體的質(zhì)粒BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶GFP、BSMVγ∶PDS以及 BSMVγ∶TaSec14，經(jīng)線性化、酚仿抽提純化后，參照普洛麥格公司RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7試劑盒對(duì)BSMV病毒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得病毒RNA。配制摩擦接種工作液：混合BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶GFP各組分RNA作為BSMV∶GFP陽性對(duì) 照 組；混 合 BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶PDS各組分RNA作為BSMV∶PDS陽性對(duì)照組；混合BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶TaSec14各組分 RNA 作為BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組。等體積混合滅活的DEPC水和GKP Buffer作為空白對(duì)照組。待感病小麥京411長(zhǎng)到第二葉完全展開時(shí)，將工作液以8 μL每份的劑量摩擦接種至葉片上。

1.2.5TaSec14基因沉默效率驗(yàn)證 首先對(duì)沉默體系的有效性進(jìn)行檢驗(yàn)，由于PDS基因是高等植物合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵基因，該基因的缺失將導(dǎo)致植株葉片白化，故對(duì)摩擦接種后BSMV∶PDS對(duì)照組葉片的白化情況進(jìn)行觀察，驗(yàn)證沉默體系的有效性。待GKP Buffer對(duì)照組、BSMV∶GFP對(duì)照組和BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組植株第三葉完全展開時(shí)，按照1.2.3中的方法接種白粉菌，并分別對(duì)接菌0 h和4 h各組植株的第三葉進(jìn)行取材。按照1.2.3方法提取各樣品總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和2-ΔΔCt法得到各組植株葉片TaSec14基因的表達(dá)量，將3個(gè)重復(fù)樣品得到的相對(duì)表達(dá)量求均值后計(jì)算TaSec14基因的沉默效率，計(jì)算方法為：

TaSec14基因的沉默效率=（1-BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組中TaSec14基因的表達(dá)量/GKP Buffer對(duì)照組中TaSec14基因的表達(dá)量）×100%

之后采用t檢驗(yàn)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異情況，將TaSec14基因的相對(duì)表達(dá)量和差異情況利用Origin 9軟件繪圖。

1.2.6 敲減TaSec14基因后的白粉菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和統(tǒng)計(jì)分析 按照1.2.3取材方法，對(duì)接種白粉菌2 d、3 d和7 d的GKP Buffer對(duì)照組、BSMV∶GFP對(duì)照組和BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組植株第三葉進(jìn)行取材。經(jīng)脫色固定、考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，用共聚焦顯微鏡觀察葉片上白粉菌孢子的發(fā)育情況。統(tǒng)計(jì)接種白粉菌24 h后BSMV∶GFP對(duì)照組和BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組植株葉片上的白粉菌分生孢子、喙型附著胞和畸形附著胞（分瓣型和纖細(xì)型）數(shù)目，每個(gè)樣品的白粉菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)3次求平均值作為樣本值。根據(jù)公式計(jì)算白粉菌的成功侵染率和畸形比率，分析基因沉默后小麥對(duì)白粉菌抗性的變化。

計(jì)算方法為：

白粉菌孢子成功侵染率=喙型附著胞/（喙型附著胞+畸形附著胞+分生孢子）×100%；

白粉菌畸形孢比率=畸形附著胞/（喙型附著胞+畸形孢+分生孢子）×100%。

2 結(jié)果

2.1 TaSec14基因的生物信息學(xué)分析

克隆得到該基因的cDNA全長(zhǎng)序列（1 564 bp）和DNA全長(zhǎng)序列（2 186 bp），利用APE軟件預(yù)測(cè)其開放閱讀框?yàn)? 212 bp，編碼403個(gè)氨基酸，如圖1所示。利用IBS 1.0.2軟件繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖，該目的基因含有兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合脂質(zhì)的CRAL_TRIO_N結(jié)構(gòu)域和具有磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能的SEC14結(jié)構(gòu)域（圖2-A），該基因包括5個(gè)外顯子和4和內(nèi)含子，呈間隔排布（圖2-B）。

Blastx比對(duì)結(jié)果顯示該基因與二穗短柄草（Brachypodium distachyon，Bd）、 玉米（Zea mays，Zm）、水稻（Oryza sativa，Os）、黍（Panicum hallii，Ph）、 棗（Ziziphus jujuba，Zj）、 蓖麻（Ricinus communis，Rc）和可可（Theobroma cacao，Tc）中Sec14蛋白家族的相似性較高，分別為80.45%、76.75%、72.38%、68.67%、67.31%、65.80% 和61.96%。利用DNAMAN軟件將該基因的氨基酸序列與其他7個(gè)物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖3所示，幾個(gè)物種Sec14結(jié)構(gòu)域部分的相似性高，說明其具有較高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該基因編碼的蛋白與多個(gè)物種中的SEC14蛋白有親緣關(guān)系，且與二穗短柄草PITP3蛋白（XP_010236107.1）的親緣關(guān)系最為接近（圖4），說明其屬于Sec14蛋白家族，故將該基因命名為TaSec14。

2.2 白粉菌脅迫下TaSec14基因的表達(dá)模式分析

以小麥TaActin作為內(nèi)參基因，分析接種白粉菌后3個(gè)小麥品種中TaSec14基因的表達(dá)模式（圖5）。發(fā)現(xiàn)在感病小麥京411中TaSec14基因的本底表達(dá)量最高，接種白粉菌之后表達(dá)量上升，在8 h達(dá)到一個(gè)高峰，之后開始下降，24 h再次達(dá)到高峰，之后再次下降。在抗病小麥BJ-1中，TaSec14表達(dá)量在接種白粉菌后開始上升，4 h達(dá)到高峰，之后開始下降，12 h后再次升高。在抗病小麥Brock中，TaSec14的表達(dá)量在接種白粉菌后先上升，8 h達(dá)到峰值，之后開始下降，在24 h后又有小幅上升。在感病小麥京411及其近等基因系BJ-1中，TaSec14基因的表達(dá)量一直高于抗病小麥Brock，并且在近等基因系BJ-1中的表達(dá)趨勢(shì)也和輪回親本京411相似。

2.3 TaSec14基因沉默體系構(gòu)建

利用特異性沉默引物SecV-F/R擴(kuò)增TaSec14基因片段，然后與BSMVγ∶載體骨架構(gòu)建BSMVγ∶TaSec14重組載體。待各組植株第三葉完全展開后，對(duì)其進(jìn)行摩擦接種。圖6是各組葉片的表型觀察結(jié)果，BSMV∶PDS對(duì)照組的葉片白化明顯，說明PDS基因被有效沉默，體系構(gòu)建成功。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組TaSec14基因轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果如圖7所示，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，接種病毒RNA后，實(shí)驗(yàn)組TaSec14的表達(dá)水平在0 h時(shí)的沉默效率為85%，在4 h時(shí)的沉默效率為90.5%，并且t檢驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中TaSec14基因的表達(dá)量與對(duì)照組的差異均達(dá)到極顯著水平，說明小麥內(nèi)源基因TaSec14的表達(dá)被有效抑制。

圖1 TaSec14基因序列信息

圖2 TaSec14基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 TaSec14基因敲減后影響白粉菌孢子發(fā)育

圖3 TaSec14同源序列比對(duì)結(jié)果

圖4 TaSec14系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

圖5 TaSec14基因在白粉菌侵染下的表達(dá)模式分析

對(duì)基因敲減后感病小麥京411接種新鮮的白粉菌孢子，觀察接種2 d、3 d和7 d后各組小麥植株的第3葉，統(tǒng)計(jì)葉片上白粉菌孢子的生長(zhǎng)發(fā)育情況，圖8是接種白粉菌孢子不同時(shí)間后細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育情況。接種白粉菌2 d后，BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組葉片上多數(shù)為未侵染成功的畸形附著孢，僅可以看到少量的喙型附著胞（圖8-C），而在GKP Buffer對(duì)照組（圖8-A）和BSMV∶GFP對(duì)照組中，已經(jīng)出現(xiàn)了初級(jí)菌絲（圖8-B）；接種白粉菌3 d后，BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組中才出現(xiàn)初級(jí)菌絲（圖8-F），而在另兩個(gè)對(duì)照組中菌絲已經(jīng)伸長(zhǎng)，個(gè)別視野下還發(fā)現(xiàn)了念珠狀的孢子（圖8-D-E）；接種白粉菌7 d后，兩個(gè)對(duì)照組中均出現(xiàn)了大量的念珠狀孢子和遍布視野的次級(jí)菌絲（圖8-G、H），而這時(shí)BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組才開始有次級(jí)菌絲形成，沒有觀察到念珠狀孢子（圖8-I）。

圖6 TaSec14基因沉默后各組植株葉片的表型觀察結(jié)果

圖7 TaSec14基因沉默效率驗(yàn)證

對(duì)每個(gè)樣品葉片上白粉菌孢子數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)3次，求平均值作為樣本值。根據(jù)1.2.6中公式計(jì)算接種白粉菌24 h之后GKP Buffer對(duì)照組和BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組上白粉菌孢子的成功侵染率和畸形率，結(jié)果如圖9所示。BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組白粉菌的成功侵染率為35.92%，略低于GKP Buffer對(duì)照組的39.31%，白粉菌孢子的畸形率為11.27%明顯高于對(duì)照組的4.05%，并且BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組中白粉菌孢子的侵染率和畸形率與GKP Buffer對(duì)照組相比，差異均達(dá)到了顯著。以上結(jié)果表明，降低TaSec14基因的表達(dá)導(dǎo)致感病小麥京411對(duì)白粉菌抗性的增加。

圖8 白粉菌脅迫下各實(shí)驗(yàn)組的白粉菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖9 白粉菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 TaSec14屬于磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

Sec14結(jié)構(gòu)域是一種高度保守且古老的脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sec14p進(jìn)化而來，在亞細(xì)胞器和細(xì)胞運(yùn)輸中執(zhí)行復(fù)雜的調(diào)節(jié)功能［19］。Sec14基因家族編碼的蛋白參與植物非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［20］、脂類的運(yùn)輸和代謝［21］、磷脂酶C調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程［22］。本研究克隆了一個(gè)在感病小麥京411中特異表達(dá)的TaSec14基因，含有典型的SEC14保守結(jié)構(gòu)域，屬于磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。

3.2 敲減TaSec14基因改變京411對(duì)白粉菌的敏感性

VIGS是一種基于RNAi的對(duì)植物特定內(nèi)源基因進(jìn)行沉默實(shí)驗(yàn)的技術(shù)［23］。由于植物體內(nèi)存在能識(shí)別外源RNA并將其降解的免疫機(jī)制［24-25］，該技術(shù)利用該免疫機(jī)制，向植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化人工改造的病毒載體，完成對(duì)基因的沉默。利用VIGS技術(shù)敲減京411中的TaSec14基因后，發(fā)現(xiàn)接種白粉菌24 h后BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組的白粉菌孢子成功侵染率低于GKP Buffer對(duì)照組，畸形率高于對(duì)照組。表明抑制TaSec14基因的表達(dá)能一定程度上提高感病小麥京411對(duì)白粉菌的抗性。

3.3 TaSec14基因在小麥與白粉菌互作中起到調(diào)控作用

本研究克隆的TaSec14基因?qū)儆赟ec14基因家族，在接種白粉菌后，TaSec14在感病小麥京411及其近等基因系BJ-1中的表達(dá)量一直高于抗病小麥Brock，降低京411中的TaSec14基因表達(dá)后，BSMV∶TaSec14實(shí)驗(yàn)組白粉菌的成功侵染率低于GKP Buffer對(duì)照組，并且畸形率明顯高于對(duì)照組，即降低內(nèi)源TaSec14基因的表達(dá)能在一定程度上增加感病小麥京411抵御白粉菌侵染的能力。因此推測(cè)，TaSec14基因可能在小麥與白粉菌互作過程中起到一定的作用。Sec14蛋白家族可以介導(dǎo)磷脂酰肌醇的代謝并參與二酰甘油-蛋白激酶C（Diacylglycerol-Protein kinase C，DAG-PKC）途徑［26］。在最新的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)［27］，稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的附著胞內(nèi)存在一個(gè)組氨酸-天冬氨酸激酶Sln1膨壓感受器，當(dāng)Sln1感受到閾值范圍內(nèi)的膨壓后，能通過PKC依賴性的途徑發(fā)揮作用，磷酸化NADPH氧化酶或調(diào)控蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）途徑，從而共同調(diào)節(jié)附著胞膨壓和入侵栓的形成，參與水稻與稻瘟病菌的互作過程。由此發(fā)現(xiàn)，Sec14與Sln1都介導(dǎo)了PKC途徑，參與了磷脂酰肌醇信號(hào)通路，且最終都影響了植物與病原菌的互作過程。我們推測(cè)，TaSec14蛋白也有可能通過PKC途徑影響其他多元醇的合成，從而參與小麥與白粉病互作過程。本實(shí)驗(yàn)對(duì)TaSec14基因功能的分析可為Sec14基因家族的研究提供新的依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究克隆得到了普通小麥中的TaSec14基因，該基因含有典型的SEC14家族保守結(jié)構(gòu)域。接種白粉菌后，感病小麥京411及其近等基因系BJ-1中TaSec14基因的表達(dá)量一直高于抗病親本Brock，且在BJ-1中的表達(dá)趨勢(shì)與輪回親本京411趨同。通過VIGS技術(shù)敲減京411中的TaSec14基因發(fā)現(xiàn)，降低京411內(nèi)源TaSec14基因的表達(dá)能在一定程度上增加其對(duì)白粉菌的抗性。推測(cè)TaSec14基因可能在小麥與白粉菌互作過程起到了調(diào)控作用。