高長春，張雪松，崔 磊，周晨笑，商 婷，梁順濤

1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000；2.北京首都醫(yī)科大學(xué)附屬世紀(jì)壇醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100000

在同種異體脂肪移植的手術(shù)當(dāng)中存在著移植后出現(xiàn)大量的移植組織壞死情況，脂肪移植技術(shù)的開展已有100多年的歷史，因其手術(shù)操作方便、充盈外形好等優(yōu)點(diǎn)而深受整形外科醫(yī)師的重視［1］，在同種自體的脂肪移植當(dāng)中雖無免疫排斥反應(yīng)但在異體脂肪移植當(dāng)中存在著以免疫排斥反應(yīng)為主的等情況影響著脂肪移植手術(shù)后移植脂肪組織的成活率［2］。由于受體與供體之間不同的免疫系統(tǒng)，移植術(shù)后會(huì)出現(xiàn)以T細(xì)胞為主的急性免疫排斥反應(yīng)與慢性排斥反應(yīng)，從而引發(fā)多種T細(xì)胞與B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答以及體液免疫應(yīng)答，影響著術(shù)后移植組織的成活率［3］。研究表明，脂肪干細(xì)胞可通過旁分泌的機(jī)制對(duì)免疫排斥反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用［4-9］。而在特定濃度的透明質(zhì)酸凝膠當(dāng)中，脂肪干細(xì)胞將會(huì)聚集成為不易流散的球體［10-11］。本文旨在研究脂肪干細(xì)胞對(duì)于同種異體脂肪移植當(dāng)中的免疫排斥反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

PBS（phosphate buffer saline）緩沖液（Eallbio公司，中國）、胎牛血清（Sciencell，美國）、DMEM（dulbecco's modified eaglemedium）低糖培養(yǎng)基（Eallbio公司，中國）、胰蛋白酶（Eallbio公司，中國）、Ⅰ型膠原酶（Worthington，中國）、HE（蘇木精-伊紅）染色試劑盒（雷根公司，中國）、BODIPY染色試劑盒（Invitrogen公司，美國）、脂周蛋白抗原（中杉金橋公司，中國）、免疫熒光染色封片劑（中杉金橋公司，中國）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)30只C57BL/6J小鼠和10只BAL/BC小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中10只BAL/BC小鼠作為異體脂肪移植的供體提供移植所需的脂肪組織，10只C57BL/6J小鼠作為脂肪干細(xì)胞細(xì)胞的提供者，10只C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組，移植過程無脂肪干細(xì)胞參與，10只C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)

組，移植過程中加入自體脂肪干細(xì)胞干預(yù)。

1.3 C57BL/6J小鼠的脂肪干細(xì)胞提取與擴(kuò)增

處死6周齡大的C57BL/6J小鼠后，提取其腹股溝部的脂肪組織剪碎并加入PBS，以1 200 g離心3分鐘后加入0.1%Ⅰ型膠原酶放置于37℃，80 g搖床50分鐘，然后以2 000 g離心15分鐘，吸棄上清，將沉淀放置于培養(yǎng)皿中，加入混有胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。放入?yún)?shù)為37℃，濃度10%的CO2培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)皿當(dāng)中的上清液，使用PBS緩沖液洗去殘余胎牛血清，加入1 m l胰蛋白酶消化脂肪干細(xì)胞，等待細(xì)胞懸浮后加入胎牛血清終止消化，以1 500 g離心5分鐘后，均勻分開放入多個(gè)培養(yǎng)皿當(dāng)中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 脂肪干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)

經(jīng)相關(guān)資料［10-11］得知，在10%濃度的透明質(zhì)酸凝膠當(dāng)中，脂肪干細(xì)胞將會(huì)獲得最佳的成球效果。所以將擴(kuò)增后的C5BL/6J的1ml的2×106數(shù)量的脂肪干細(xì)胞單細(xì)胞懸液滴于1 ml的20%透明質(zhì)酸凝膠中，12小時(shí)后，得到包含1×106/ml成球脂肪干細(xì)胞的濃度為10%的透明質(zhì)酸凝膠（圖1A）。

1.5 同種異體脂肪移植手術(shù)

處死6周齡大的供體BAL/BC小鼠后，提取其腹股溝部的脂肪組織，剪碎（圖1B）。與含有成球C57BL/6J小鼠脂肪干細(xì)胞均勻混合（圖1C）。采用1m l注射器吸取移植液體備用（圖1D）。將受體C57BL/6J小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射濃度為5%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，等待完全麻醉，由于小鼠的頭部皮下組織緊密，異于其他部位的皮膚于皮下組織較為寬松，不利于移植脂肪的固定栽種，所以挑選小鼠的頭部位置作為同種異體脂肪移植的預(yù)定位置，小鼠的頭皮下部位可以較為牢固的將移植脂肪固定，有利于達(dá)到取材時(shí)間點(diǎn)時(shí)對(duì)移植的脂肪進(jìn)行取材，首先將頭部（移植部位）毛發(fā)剔除，以便于開放視野，有利于在預(yù)定位置進(jìn)行移植，然后提起小鼠松弛的背頸部皮膚，使用25 m l注射器的針頭從小鼠背頸刺入，沿皮下行至頭皮部位后，按壓針頭所在的位置，防止移植脂肪組織流散，緩慢推壓注射器，將注射器內(nèi)的移植脂肪組織通過針頭注射至小鼠的頭皮下，每只小鼠的注射移植量為0.2 m l，對(duì)照組為0.2 m l純脂肪組織，實(shí)驗(yàn)組為0.1 m l的脂肪組織加0.1 m l含有脂肪干細(xì)胞的透明質(zhì)酸凝膠，總計(jì)0.2 m l。注射完成后迅速抽出針頭，同時(shí)在退針部位按壓10分鐘，防止移植脂肪組織跟隨針頭出入軌跡溢出。等待至小鼠麻醉恢復(fù)后，放入籠舍，繼續(xù)按照正常標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，等待取材日期。

圖1 成球ADSC的制備以及同種異體脂肪的手術(shù)示意圖

1.6 移植脂肪取材檢測

在同種異體脂肪手術(shù)3個(gè)月后將受體C57BL/6J小鼠處死，并取出頭皮下的移植脂肪作為樣本進(jìn)行如下檢測：（1）HE檢測：將移植物組織塊進(jìn)行石蠟包埋，切片，利用堿性的蘇木精染色將細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)紫色，利用酸性的伊紅染液將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記為紅色。（2）BODIPY顏色：使用BODIPY493/503染色特異性的標(biāo)記脂滴,BODIPY染料是一種近紅外的短波長熒光染料，特異性的作用于中性脂組成的脂滴，通過熒光顯微鏡的激發(fā)光在鏡下呈現(xiàn)出帶有綠色熒光的脂滴輪廓。（3）脂周蛋白免疫熒光染色：脂周蛋白是一類由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性內(nèi)核和由蛋白質(zhì)、磷脂、膽固醇等組成的外殼構(gòu)成的球狀微粒，在脂肪細(xì)胞的正常代謝過程當(dāng)中起重要作用，借此可以將脂周蛋白作為活性脂肪細(xì)胞的特異性標(biāo)記，使其作為免疫熒光染色的特異性抗原被標(biāo)記，而后使用熒光顯微鏡觀察移植物當(dāng)中脂周蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)也代表著移植脂肪細(xì)胞的存活情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正太分布資料采用Mann-WhitneyY檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析和LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在手術(shù)完成結(jié)束后，有7只對(duì)照組小鼠的頭皮下移植脂肪流散被消化吸收無法取材，有5只實(shí)驗(yàn)組小鼠的頭皮下移植脂肪被消化吸收無法取材。將采取如下改進(jìn)措施：在完成頭皮下注射移植脂肪后，使用外科縫合的方式對(duì)移植部位（頭皮下）進(jìn)行縫合固定，防止移植脂肪與HA凝膠所組成的流體在皮下流散難以取材。

手術(shù)完成3個(gè)月后，分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠進(jìn)行處死，取材。然后將取出移植脂肪進(jìn)行HE染色，BODIPY染色以及脂周蛋白免疫熒光檢測，見圖2。

圖2 有無ADSC參與的移植脂肪檢測結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察脂周蛋白免疫熒光切片，每只小鼠進(jìn)行3次于10×10鏡下視野中計(jì)數(shù)成活脂肪細(xì)胞個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見圖3。

圖3 脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

根據(jù)結(jié)果顯示，有脂肪干細(xì)胞參與的同種異體脂肪移植實(shí)驗(yàn)的術(shù)后脂肪存活率高于沒有脂肪干細(xì)胞參與的同種異體脂肪移植實(shí)驗(yàn)的術(shù)后脂肪存活率，說明脂肪干細(xì)胞對(duì)于同種異體脂肪移植排斥反應(yīng)有一定的抑制作用。

3 討論

現(xiàn)有研究結(jié)果已經(jīng)表明自體脂肪移植手術(shù)的可行性，而在異體脂肪移植手術(shù)當(dāng)中存在著各種免疫排斥反應(yīng)，本

文已初步探索ADSC對(duì)于異體脂肪移植手術(shù)當(dāng)中免疫排斥的抑制作用，或可通過這種抑制效果來提升術(shù)后移植脂肪的存活率［12-14］。然而對(duì)于異體脂肪移植后脂肪細(xì)胞的存活率提高具體可達(dá)到何種效果，還有待于進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

在異體脂肪移植手術(shù)中以及移植術(shù)后的恢復(fù)階段，會(huì)發(fā)生總計(jì)三種不同類型的免疫排斥反應(yīng)，其發(fā)生的機(jī)制也各不相同，第一種類型是超急性免疫排斥反應(yīng)，主要發(fā)生時(shí)間為移植物與宿主血管接通后的數(shù)分鐘至24小時(shí)內(nèi)，發(fā)生機(jī)制為在移植前已經(jīng)產(chǎn)生供體同種異型抗原特異性抗體，在其他方面常見于反復(fù)輸血，多次妊娠以及再次移植等情況，在本次研究當(dāng)中可以忽略不計(jì)，第二種類型是急性免疫排斥反應(yīng)，發(fā)生時(shí)間為移植后數(shù)天或數(shù)周，作為本次實(shí)驗(yàn)的主要排斥反應(yīng)，其主要發(fā)生的是細(xì)胞免疫應(yīng)答。急性免疫排斥反應(yīng)還分為早期急性免疫排斥反正和中期急性免疫排斥反應(yīng)，其中早期急性免疫排斥反應(yīng)的主要發(fā)生機(jī)制為T細(xì)胞通過直接識(shí)別的方式活化，引發(fā)以CD8+CTL為主、CD4+TH1為輔的細(xì)胞免疫應(yīng)答，中期急性免疫排斥反應(yīng)的主要發(fā)生機(jī)制為T細(xì)胞通過間接識(shí)別的方式活化，以CD4+TH1細(xì)胞通過釋放TH1型細(xì)胞因子介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答為主；以CD4+TH2細(xì)胞與B細(xì)胞協(xié)同作用介導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答為輔。第三種類型是慢性免疫排斥反應(yīng)，發(fā)生時(shí)間為術(shù)后數(shù)月甚至數(shù)年，主要的病理特征為血管壁炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化。引起慢性免疫排斥反應(yīng)的主要因素有：（1）、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)所產(chǎn)生的免疫損傷；（2）、B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體活化補(bǔ)體或通過ADCC（抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞；（3）、急性免疫排斥反應(yīng)反復(fù)發(fā)作所導(dǎo)致的移植物退行性性變。各種不用免疫排斥反應(yīng)在不同時(shí)間段當(dāng)中發(fā)生，以各種方式對(duì)移植物造成的損傷導(dǎo)致了異體脂肪移植術(shù)的移植脂肪成活率低下，而將宿主的脂肪干細(xì)胞與移植脂肪進(jìn)行混合，將會(huì)對(duì)移植脂肪的成活率有所幫助［15-18］。

然而，脂肪干細(xì)胞究竟是通過什么方式改善了同種異體脂肪移植中移植物的成活狀況［19］，究竟抑制了哪種免疫排斥反應(yīng)類型當(dāng)中的哪種發(fā)生機(jī)制以及脂肪干細(xì)胞在異體移植后的轉(zhuǎn)歸問題仍舊未可知也，這些問題還期待著進(jìn)一步的深入探索。