陳 建，李 剛

川崎病又名皮膚黏膜淋巴綜合征，是兒科常見的一種全身免疫系統(tǒng)中小血管炎性疾病，多發(fā)于5歲以下兒童，以發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大、手足硬性水腫為臨床表現(xiàn)，病理改變可涉及全身多器官系統(tǒng)，其中以冠狀動(dòng)脈損害最為常見。研究表明，川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生率高達(dá)30%，一般以冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張或冠狀動(dòng)脈瘤為主，已成為導(dǎo)致患兒死亡的重要心血管并發(fā)癥[1]。目前臨床上對于川崎病患兒是否可能并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害尚無特異性預(yù)測指標(biāo)，僅僅依靠醫(yī)生臨床經(jīng)驗(yàn)及部分明顯性癥狀出現(xiàn)后才能確診，治療難度大，因此，亟須尋找一種可特異性反映川崎病患兒并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的生物學(xué)指標(biāo)來對患兒進(jìn)行早期預(yù)測，以加強(qiáng)監(jiān)測，改善治療效果，降低患兒死亡率。微小核糖核酸-145(microRNA-145，miR-145)是在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)較為豐富的一種microRNA，可作為血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型轉(zhuǎn)化為分泌表型的一種重要標(biāo)志物，通過多種機(jī)制參與心血管疾病發(fā)展過程[2]。心肌素基因最早克隆自小鼠心臟cDNA，屬核蛋白SAP結(jié)構(gòu)域家族，可通過激活miR-145表達(dá)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化，參與受損血管修復(fù)過程[3]。以往臨床上對miR-145和心肌素的研究多集中于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血或腫瘤等疾病，在川崎病患兒中研究較少。因此，本研究擬通過檢測川崎病患兒血清miR-145及心肌素水平，分析二者表達(dá)情況與川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損害的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2002年日本川崎病研究委員會(huì)修訂的第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，①持續(xù)發(fā)熱≥5 d；②雙側(cè)眼結(jié)膜充血；③出現(xiàn)楊梅舌，口腔咽部黏膜呈彌漫性充血；④出現(xiàn)皮疹、紅斑等皮膚性變化；⑤急性期患兒四肢出現(xiàn)硬性水腫，恢復(fù)期患兒皮膚移行處出現(xiàn)膜樣脫皮；⑥單側(cè)頸部出現(xiàn)直徑>1.5 cm的非化膿性淋巴結(jié)腫大。滿足以上任意5條即可確診為川崎病。合并冠狀動(dòng)脈損害診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：采用超聲心動(dòng)圖檢查冠狀動(dòng)脈，若①冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜回聲增強(qiáng)，冠狀動(dòng)脈腔呈現(xiàn)明顯不規(guī)則；②某一段冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑超過相鄰段1.5倍；③3歲以下患兒表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑超過2.5 mm，3～9歲患兒超過3 mm，9～14歲患兒超過3.5 mm。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述標(biāo)準(zhǔn)確診為川崎病患兒；②年齡≤5歲患兒；③納入研究前未進(jìn)行過影響本次研究結(jié)果的治療患兒；④患兒及監(jiān)護(hù)人同意本次研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并血液系統(tǒng)疾病、自身免疫疾病患兒；②合并肝、腎等重要器官嚴(yán)重病變患兒；③依從性差患兒。

1.2 臨床資料 選取2015年5月—2018年10月眉山市婦幼保健院和西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的川崎病患兒72例為研究對象，按照是否出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈損害分為無損害組和損害組。無損害組40例，男23例，女17例；年齡5～57(32.19±6.45)個(gè)月。損害組32例，男18例，女14例；年齡6～60(33.28±6.77)個(gè)月。另選同期在眉山市婦幼保健院體檢性別、年齡相仿的健康志愿者40名為對照組，男22名，女18名；年齡5～60(33.75±6.92)個(gè)月。3組研究對象在年齡、性別等基本資料方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床生化指標(biāo)收集 采用全自動(dòng)生化分析儀收集C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、血小板計(jì)數(shù)(blood platelet，PLT)等常規(guī)臨床生化指標(biāo)，對照組數(shù)據(jù)均于體檢當(dāng)日獲得。

1.3.2 炎癥相關(guān)因子 抽取頸靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，試劑盒均購自深圳科潤達(dá)生物工程有限公司。

1.3.3 血清miR-145水平 抽取頸靜脈血，采用熒光定量PCR技術(shù)測定血清miR-145表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司，并嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。定量PCR條件首先是94 ℃預(yù)變性3 min，然后按照94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s的程序進(jìn)行，反應(yīng)共設(shè)置40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參，引物序列如下，miR-145正向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反向引物：5′-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3′，U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 血清心肌素水平 采集患兒入院后頸靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清心肌素水平，試劑盒購自上海盈公生物技術(shù)有限公司。

2 結(jié) 果

2.1 3組臨床生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較 冠狀動(dòng)脈損害組患兒血清CRP、WBC、PLT、ESR水平高于冠狀動(dòng)脈無損害組和對照組(P<0.05)，且冠狀動(dòng)脈無損害組高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

組別例數(shù)CRP(mg/L)WBC(×109/L)PLT(×109/L)ESR(mm/h)對照組 402.51±0.57 15.79±3.18 222.54±40.87 11.38±2.06 無損害組409.74±2.86①28.19±5.62①310.12±61.53①27.94±5.22①損害組 3220.55±4.29①②37.83±7.24①②435.51±84.99①②52.73±10.49①②F值350.461147.689100.786358.074P 0.000 0.000 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與無損害組比較，②P<0.05。

2.2 3組血清炎癥相關(guān)因子水平比較 冠狀動(dòng)脈損害組血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平高于冠狀動(dòng)脈無損害組和對照組(P<0.05)，且冠狀動(dòng)脈無損害組高于對照組(P<0.05)。詳見表2。

組別例數(shù)IL-6IL-8IL-10TNF-α對照組 4023.59±4.46 10.37±1.96 9.77±1.85 11.46±2.35 無損害組4048.91±9.73①25.48±5.03①21.07±4.13①20.84±4.11①損害組3265.42±13.01①②38.14±7.52①②30.21±5.88①②29.78±5.63①②F值181.035262.289220.088176.289P 0.000 0.000 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與無損害組比較，②P<0.05。

2.3 3組血清miR-145及心肌素水平比較 冠狀動(dòng)脈損害組血清miR-145及心肌素水平低于冠狀動(dòng)脈無損害組和對照組(P<0.05)，且冠狀動(dòng)脈無損害組低于對照組(P<0.05)。詳見表3。

組別例數(shù)miR-145相對表達(dá)量心肌素(ng/L)對照組402.65±0.51267.45±51.28無損害組401.97±0.39①154.59±32.08①損害組321.08±0.22①②85.64±17.96①②F值135.903219.178P 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與無損害組比較，②P<0.05。

2.4 相關(guān)性分析 miR-145在川崎病患兒血清中表達(dá)水平與心肌素水平呈正相關(guān)(P<0.01)，在冠狀動(dòng)脈損害組中相關(guān)系數(shù)為0.847。詳見圖1。在冠狀動(dòng)脈無損害組中相關(guān)系數(shù)為0.792。詳見圖2。

圖1 冠狀動(dòng)脈損害組川崎病患兒血清中miR-145與心肌素的相關(guān)性分析

圖2 冠狀動(dòng)脈無損害組川崎病患兒血清中miR-145與心肌素的相關(guān)性分析

2.5 Logistic回歸分析結(jié)果 以川崎病患兒是否并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害為應(yīng)變量，以患兒年齡、血清CRP、WBC、PLT、ESR、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、miR-145及心肌素水平為自變量行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，低水平的血清miR-145及心肌素是川崎病患兒并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 影響川崎病患兒并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的Logistic回歸分析

3 討 論

川崎病是一種急性發(fā)熱出疹性疾病，病因復(fù)雜，具有明顯的季節(jié)性、地域性和年齡特點(diǎn)[6]。大量研究顯示，川崎病可能與感染引起的氣管炎癥性損傷、機(jī)體免疫失調(diào)有關(guān)[7]，自然界中存在川崎病感染源，人體一旦感染可引起體內(nèi)T細(xì)胞異?；罨琓h1/Th2細(xì)胞失衡，CD25、CD30等大量活化分子過度表達(dá)，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，造成血管內(nèi)皮和部分組織細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血管局部浸潤，出現(xiàn)全身中小血管炎性損傷，進(jìn)而引發(fā)川崎病。CRP是由肝細(xì)胞合成的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在病人體內(nèi)出現(xiàn)急性炎癥時(shí)表達(dá)水平快速升高，炎癥水平下降時(shí)其含量隨之下降[8]。本研究結(jié)果顯示，冠狀動(dòng)脈損害組患兒血清CRP、WBC、PLT、ESR水平高于冠狀動(dòng)脈無損害組和對照組，且冠狀動(dòng)脈無損害組高于對照組，提示川崎病可引起患兒血清CRP、WBC、PLT、ESR水平升高，且合并冠狀動(dòng)脈損害病人升高程度大于無冠狀動(dòng)脈損害患兒。川崎病患兒血液循環(huán)中含有部分免疫小復(fù)合物，可阻滯正常情況下網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對部分聚集或黏附血小板的清除作用，導(dǎo)致血小板水平升高，從而引起組織胺釋放量增加，造成免疫復(fù)合物沉積，產(chǎn)生血管內(nèi)皮損傷[9]。ESR是指一定時(shí)間內(nèi)紅細(xì)胞的下沉距離，可在有大量炎性介質(zhì)和免疫球蛋白存在的高度活化免疫系統(tǒng)中高表達(dá)[10]。本研究對部分血清炎癥相關(guān)因子分析結(jié)果顯示，冠狀動(dòng)脈損害組血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平高于冠狀動(dòng)脈無損害組和對照組，且冠狀動(dòng)脈無損害組高于對照組，提示IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α可能參與川崎病合并冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)生發(fā)展過程。IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α是由T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等分泌的具有生物學(xué)效應(yīng)的促炎介質(zhì)，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)血小板聚集，調(diào)控組織因子表達(dá)，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈受到損害。

microRNA是具有高度保守性的內(nèi)源非編碼單鏈小分子RNA，與目的基因的3′非翻譯區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合，在基因轉(zhuǎn)錄后水平上參與調(diào)控，穩(wěn)定存在于血清、血漿等組織體液中，在機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡及免疫炎癥反應(yīng)方面起重要的作用[11]。miR-145是位于人類5q32染色體上的一種microRNA，與血管平滑肌分化狀態(tài)密切相關(guān)，其靶標(biāo)基因KLF5可上調(diào)SM22α、SMα-MHC和SMα-actin等血管平滑肌表型分化標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄水平，在多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[12]。心肌素定位于人類染色體17p11.2，含有807個(gè)氨基酸，是分化狀態(tài)下血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志性基因的重要下游調(diào)控元件，可正向調(diào)控miR-145表達(dá)，負(fù)向調(diào)控KLF5表達(dá)[13]?？籽┰频萚14]研究顯示，血管平滑肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，可引起血清miR-145及心肌素水平下降，KLF5水平升高，從而促進(jìn)血管平滑肌去分化，導(dǎo)致血管炎性損傷。Jeffrey等[15]通過對小鼠胚胎研究顯示，miR-145和心肌素之間存在相互影響作用，一方面miR-145的3′非翻譯區(qū)可直接與心肌素結(jié)合，通過上調(diào)血清反應(yīng)因子復(fù)合物和心肌素水平，增強(qiáng)自身表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌分化，減輕血管內(nèi)

膜損傷程度，緩解心血管疾??；另一方面，心肌素也可通過激活miR-145表達(dá)來參與血管損傷修復(fù)過程。本研究結(jié)果顯示，冠狀動(dòng)脈損害組患兒血清miR-145及心肌素水平低于冠狀動(dòng)脈無損害組和對照組，且冠狀動(dòng)脈無損害組低于對照組，提示miR-145及心肌素在川崎病患兒血清中低表達(dá)，且在合并冠狀動(dòng)脈損害組患兒血清中的表達(dá)水平低于冠狀動(dòng)脈無損害組。相關(guān)性分析顯示，miR-145在川崎病患兒血清中表達(dá)水平與心肌素水平呈正相關(guān)，在冠狀動(dòng)脈損害組中相關(guān)系數(shù)為0.847，在冠狀動(dòng)脈無損害組中相關(guān)系數(shù)為0.792，提示miR-145和心肌素可能通過某種機(jī)制共同參與川崎病合并冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析顯示，低水平的血清miR-145、心肌素是川崎病患兒并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的危險(xiǎn)因素，提示可通過檢測川崎病患兒血清miR-145、心肌素水平來預(yù)測冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)生。

綜上所述，miR-145、心肌素在川崎病合并冠狀動(dòng)脈患兒血清中低表達(dá)，低水平的血清miR-145、心肌素是川崎病患兒并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的危險(xiǎn)因素。本研究不足之處在于未對血清miR-145、心肌素水平預(yù)測冠狀動(dòng)脈損害的靈敏度及特異性進(jìn)行進(jìn)一步分析，因此，在后續(xù)研究中將會(huì)逐步涉及。