張正升，韓貴芝，張丹丹，張 申，林 立，張兆強

缺血性心臟病是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，以冠心病心絞痛和急性心肌梗死最常見[1]。我國每年由突發(fā)性冠心病心絞痛和急性心肌梗死引起的死亡率高達3.2%。缺血性心臟病在我國的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，早期預(yù)防和控制是降低其發(fā)生的重要策略[2]。大蒜素具有降血脂、擴張血管、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降血壓、防治心腦血管疾病等作用[3]。近年來，國內(nèi)外大量研究表明，大蒜素作用于缺血性心臟病的多個發(fā)病環(huán)節(jié)，降低冠狀動脈灌注壓和心臟負(fù)荷，通過低壓低速灌注可防治再灌注損傷，對缺血性心臟病心肌具有保護作用，大蒜素的作用機制也成了研究的熱點[4-5]。本研究旨在探討大蒜素的心肌保護作用是否與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)受體mRNA表達有關(guān)，尋找大蒜素在心肌內(nèi)的作用靶點，探究大蒜素對心肌缺血保護的分子生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特異性病原菌級別(SPF)10～12周齡Wester大鼠80只，雌雄各半，體重(230±20)g。由濟寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 大蒜素(上海源葉生物科技有限公司)；臺式大容量冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；YXQ602型電熱式蒸汽消毒器(山東新華器械股份有限公司)；Arktik5020型多功能PCR儀(賽默飛世爾科技公司)；實時熒光定量PCR儀(美國伯樂CFX96)；PCR8聯(lián)管(無錫國盛生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠心肌缺血模型 腹腔注射異丙腎上腺素(3 mg/kg)，每日2次，上午、下午各1次，連續(xù)3周，制造大鼠急性心肌缺血模型。通過檢測心電圖、血清肌鈣蛋白含量確定心肌缺血模型是否構(gòu)建成功。對照組注射等量的生理鹽水。

1.3.2 分組和處理方法 將模型大鼠按照完全隨機化原則分為4組：大蒜素高、中、低劑量組和模型組，每組12只；另取12只正常大鼠作為正常對照組。高、中、低劑量組分別灌胃大豆油配制的400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg濃度的大蒜素，模型組和對照組灌胃等容量的大豆油，等容灌胃量0.1 mL/10 g。

1.4 指標(biāo)測定方法

1.4.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 取左心室心尖處心肌組織1～2 mm，放在4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，電光鏡觀察大鼠左心室心肌組織的病理變化。

1.4.2 血清和心肌組織中CGRP含量 摘眼球取血，離心取血清，解剖取心臟，制備心肌組織勻漿液，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清和心肌組織中CGRP含量。

1.4.3 心肌細胞總RNA 染毒試驗結(jié)束后，取各組大鼠心肌組織，研磨，用生理鹽水洗滌3次。采用Trizol試劑抽提細胞總RNA，操作步驟根據(jù)說明書進行。

1.4.4 引物和內(nèi)參的設(shè)計 從美國國家生物信息中心(NCBI)獲取大鼠CGRP 受體mRNA的基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計CGRP受體 mRNA引物。詳見表1。

1.4.5 CGRP受體mRNA熒光定量PCR的產(chǎn)物電泳 將提取出的總RNA電泳分離CGRP受體mRNA，將擴增產(chǎn)物進行PCR擴增，進行實時熒光定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況 在建立模型的過程中，大鼠毛色發(fā)暗，精神狀態(tài)較差，大部分大鼠糞便不成形，稀、軟糞便黏到籠壁和籠底。灌胃大蒜素后，大蒜素各劑量組大鼠的精神狀態(tài)日漸好轉(zhuǎn)，較模型組大鼠更活躍，灌胃過程中模型組大鼠出現(xiàn)感冒、打噴嚏等癥狀，大蒜素各劑量組和對照組大鼠未出現(xiàn)感冒、打噴嚏等癥狀，表現(xiàn)出較強的抵抗力。

2.2 大鼠心肌組織病理變化 正常對照組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌細胞排列均勻，細胞充盈；模型組心肌纖維溶解無規(guī)則，心肌細胞空泡化，大量噬堿性細胞和炎性細胞浸潤；大蒜素各劑量組炎性細胞減少，心肌纖維排列較規(guī)律。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理切片HE染色(×400)

2.3 各組大鼠血清和心肌組織中CGRP含量比較 大蒜素各劑量組與模型組心肌CGRP水平均低于正常對照組(P<0.05)。與模型組比較，大蒜素中、高劑量組心肌組織中CGRP含量升高(P<0.05)。各組血清中CGRP含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

組別只數(shù)血清CGRP心肌CGRP正常對照組 1241.56±1.9955.15±1.67 模型組 1227.56±4.3748.65±3.40①大蒜素低劑量組1230.43±2.0050.35±2.44①大蒜素中劑量組1239.09±2.8151.85±3.21①②大蒜素高劑量組1239.78±7.5152.05±4.12①②F值1.6789.268P0.1770.000

與正常對照組比較， ①P<0.05；與模型組比較， ②P<0.05。

2.4 PCR羧基熒光素檢測 對提取的總RNA進行熒光PCR擴增，通過對CGRP mRNA反應(yīng)的擴增曲線和溶解曲線進行分析表明，mRNA濃度對數(shù)值和循環(huán)閾值之間呈正相關(guān)線性關(guān)系。詳見圖2、圖3。

圖2 CGRP受體 mRNA擴增曲線

圖3 CGRP 受體mRNA溶解曲線

2.5 各組大鼠心肌組織CGRP 受體mRNA表達水平比較 各組大鼠心肌組織CGRP受體mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.800，P=0.001)。與正常對照組比較，大蒜素各劑量組心肌組織CGRP受體mRNA表達水平均降低(P<0.05)；大蒜素低劑量組、中劑量組CGRP受體 mRNA表達水平較模型組增高(P<0.05)。表明一定劑量的大蒜素可以在一定范圍內(nèi)提高CGRP 受體mRNA的表達水平，改善和緩解心肌供血，但不能恢復(fù)到正常水平。詳見表3。

組別只數(shù)CGRP受體mRNA正常對照組 121.32±1.24 模型組 120.55±1.54①大蒜素低劑量組120.78±0.24①②大蒜素中劑量組120.82±0.48①②大蒜素高劑量組120.59±0.26①F值5.800P0.001

與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<

0.05。

3 討 論

CGRP是一種短鏈活性生物多肽，由37個氨基酸組成，廣泛分布于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是一種活性很強的擴血管物質(zhì)，其擴血管作用強于乙酰膽堿、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)等，CGRP功能多樣，有舒張血管、抑制血管平滑肌細胞凋亡和增殖等功能[6-7]。國內(nèi)外研究表明，大蒜素對心肌的作用機制主要包括大蒜素可有效清除超氧陰離子自由基，抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；促進擴張血管物質(zhì)產(chǎn)生，如一氧化氮(NO)、硫化氫(H2S)、一氧化氮合成酶(NOS)；在高濃度下抑制心房心肌細胞內(nèi)鈣超載鈣拮抗等作用；延緩心肌細胞凋亡；使心室肌細胞鈣電流-電壓曲線明顯上移，抑制心肌細胞L-型鈣通道等[8-14]。大蒜素對心肌收縮力的影響仍存在爭議。

本研究結(jié)果表明，一定劑量的大蒜素可以提高大鼠心肌組織中CGRP受體 mRNA表達水平，增加血管平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞中CGRP受體的表達，增強CGRP對心肌血管平滑肌和血管內(nèi)皮細胞的擴血管調(diào)控保護作用，改善缺血心肌的供血，但是不能恢復(fù)到正常水平，能夠為大蒜素預(yù)防和緩解缺血性心臟病提供理論依據(jù)。