王甜，王歡博，安廣洲，張俊平，4，張克英，周艷，李靜，郭玲，李和平，丁桂榮

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系/輻射防護(hù)醫(yī)學(xué)教研室，陜西西安710032；2.西安市中心醫(yī)院神外微創(chuàng)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西西安710032；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員隊，陜西西安710032；4.中國人民解放軍61255部隊，山西侯馬043000；5.清華大學(xué)工程物理系，北京100084

前言

腦膠質(zhì)瘤和宮頸癌是較常見的兩種腫瘤，嚴(yán)重危害著人類健康。目前臨床上治療這兩種疾病主要采取手術(shù)、化療及放療相結(jié)合的方式，雖然有一定療效，同時也伴隨著比較明顯的副作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，大氣壓冷等離子體（Cold Atmospheric Plasma,CAP）射流在滅菌［1］、促進(jìn)傷口愈合［2］及殺傷癌細(xì)胞［3］等方面具有良好的效果且無明顯副作用，顯示了其潛在的應(yīng)用前景。CAP射流溫度低，在作用區(qū)域內(nèi)不會產(chǎn)生明顯的不適，特別是在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，不會導(dǎo)致正常組織的損傷，具有安全、有效靶向治療腫瘤的潛力，已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點之一［4］。

研究發(fā)現(xiàn)不同組織來源的細(xì)胞對等離子體的敏感性不同。據(jù)報道，電壓為2～5 kV，頻率為30 kHz的冷等離子體處理皮下膀胱癌腫瘤，能夠使腫瘤顯著減小，并不會造成皮膚損傷，該參數(shù)的等離子體還可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞SW900 脫離培養(yǎng)平板，但對正常的支氣管上皮細(xì)胞（Human Bronchial Epithelial Cells,NHBE）沒有影響［5］；電壓3 kV、頻率25 kHz 的冷等離子體處理可降低瘢痕瘤細(xì)胞keloid的遷移能力和膠原形成，而對正常的成纖維細(xì)胞卻具有相反的作用［6］；用8 kV，10 L/min 的CAP 處理4種鱗狀細(xì)胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC）細(xì)胞（JHU-022,JHU-028,JHU-029,SCC25），結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAP 能降低HNSCC 細(xì)胞的活力，其作用效果與處理時間和射流大小等有關(guān)，但是對口腔正常上皮細(xì)胞系OKF6 和NOKsi 的細(xì)胞活力沒有明顯影響［7］，表明正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對等離子體的敏感性不同。不同來源的腫瘤細(xì)胞對CAP 是否亦存在敏感性差異？目前尚不清楚。本研究以兩種不同組織來源腫瘤細(xì)胞（腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和宮頸癌細(xì)胞Hela）為研究對象，探討CAP 對其增殖和凋亡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（四季青），0.25%胰酶-EDTA溶液（索萊寶），BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天），CCK-8 增殖檢測試劑盒（七海公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（索萊寶），小鼠抗caspase3 抗體（abcam），兔抗Nrf2 抗體（abcam），小鼠抗GAPDH 抗體（invitrogen），山羊抗兔lgG(H+L)（Invitrogen），山羊抗鼠lgG(H+L)（Invitrogen）。

1.2 CAP射流裝置

本研究中采用的是高度集成的CAP 發(fā)生器CAP-Med，如圖1a所示。該裝置來自于清華大學(xué)等離子體健康科技組（PHSG），包括高壓交流電源模塊、氦氣流速控制模塊、驅(qū)動頻率及輸出電壓控制旋鈕模塊和同軸型介質(zhì)阻擋放電（Dielectric Barrier Discharge,DBD）等離子體發(fā)生器，氦等離子體射流由發(fā)生器下方噴口處噴出，與被處理細(xì)胞培養(yǎng)液接觸。發(fā)生器結(jié)構(gòu)如圖1b所示，直徑為1.00 mm的長鎢絲被用作高壓電極，薄銅片則作為地電極，兩電極間表面均覆蓋著厚度為1.00 mm的石英管作為介質(zhì)層，兩石英管間的放電間隙寬度為1.50 mm，聚四氟乙烯作為絕緣層，包裹在發(fā)生器外側(cè)。穩(wěn)定氦氣放電的驅(qū)動頻率f=17.00 kHz，放電電壓Vd=2.57 kV，放電電流Id=8.33 mA，輸入功率Pin=9.65 W，氦氣的流量固定為Q=10.81 slpm（standard liters per minute）。處理細(xì)胞時，將等離子體發(fā)生器噴嘴垂直置于細(xì)胞培養(yǎng)液面上方約3 mm處，通過移動噴嘴實現(xiàn)對細(xì)胞的均勻處理。

圖1 CAP Med照片（a）和介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)（b）Fig.1 Picture of CAP Med(a)and the schematic structure of dielectric barrier discharge plasma generator(b)

圖2是利用ICCD（Andor,DH334T-18U-03）在發(fā)生器噴嘴下方垂直距離3 mm 處采集的發(fā)射光譜，可以看出由同軸型介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器產(chǎn)生的氦射流中不僅包含了大量的氦粒子，同時也包含大量活性氮氧基團，如NO、OH，主要來自于等離子體射流中電子、氦粒子與空氣中氣體分子（N2、O2、H2O）間的相互作用。在這些基團中，NO 在幫助細(xì)胞抵抗腫瘤和有害微生物方面體現(xiàn)出了較大潛力［8-9］，因此是等離子體醫(yī)學(xué)中最受關(guān)注的活性粒子之一；OH 在液相條件下可形成長壽命的H2O2分子，進(jìn)而可作為調(diào)節(jié)細(xì)胞間交流的信號分子［10］。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

圖2 氦氣等離子體射流的發(fā)射光譜Fig.2 Emission spectrum of helium plasma jet

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87 和宮頸癌細(xì)胞系Hela均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞的生長情況，定期換液。細(xì)胞長至80%融合后，用0.25%的胰酶-EDTA溶液消化傳代。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將處于對數(shù)生長期的U87和Hela細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種3 000個細(xì)胞，每組設(shè)5個復(fù)孔。分別設(shè)置正常對照組（不處理），He處理組，CAP處理不同時間（30、60、90 s）組。處理完畢后，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于處理后24、48、72和96 h，加入CCK-8試劑，使用酶標(biāo)分析儀檢測450 nm波長處的吸光度值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將對數(shù)生長期的U87和Hela細(xì)胞接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，分為正常對照組、He 處理組、CAP 處理60 s組，細(xì)胞長至密度為60%左右時，CAP 處理，在處理后24 h 消化收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明染色，上流式細(xì)胞儀檢測，分析凋亡率的變化。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

將處于對數(shù)生長期的U87 和Hela 細(xì)胞接種至6孔板，長至60%～70%融合后，隨機分為正常對照組，He 處理組，CAP 處理不同時間（30、60、90 s）組，處理后24 h，用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA 法測蛋白濃度。采用12%的下層膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%的牛奶TBST 室溫封閉2 h，接著孵育一抗，小鼠抗caspase3（1：1 000），兔抗Nrf2（1：1 000），4 ℃過夜，然后孵育二抗，山羊抗兔（1：50 000）和山羊抗小鼠（1：100 000），每個步驟都用TBST 洗滌3次，每次10 min，最后化學(xué)發(fā)光成像后用Image J軟件分析蛋白表達(dá)情況。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個樣本間的均數(shù)比較用單因素方差分析，兩樣本間均數(shù)比較用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測結(jié)果

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，U87 和Hela 細(xì)胞經(jīng)純He 處理后，其細(xì)胞增殖能力沒有顯著變化，Hela 細(xì)胞經(jīng)30 s CAP 處理后，細(xì)胞的增殖能力即受到顯著抑制，U87細(xì)胞增殖無明顯變化（圖3、4），兩種細(xì)胞經(jīng)60 和90 s CAP 處理后，增殖均受到顯著抑制（圖3、4），對U87 細(xì)胞而言，CAP 處理時間越長，增殖抑制作用越明顯。

圖3 Hela細(xì)胞經(jīng)CAP不同時間處理后的生長情況Fig.3 Proliferation curve of Hela cells after CAP treatment for different durations

圖4 U87細(xì)胞經(jīng)CAP不同時間處理后的生長情況Fig.4 Proliferation curve of U87 cells after CAP treatment for different durations

2.2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，He 處理后U87 和Hela 細(xì)胞的凋亡率沒有顯著變化，用CAP處理60 s后24 h，兩種細(xì)胞的凋亡率與對照組相比均顯著增加（P＜0.01）（圖5、6）。

2.3 免疫印跡結(jié)果

免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，He處理組的調(diào)亡相關(guān)蛋白（caspase3）和氧化應(yīng)激關(guān)鍵蛋白（Nrf2）水平?jīng)]有顯著變化，CAP 處理不同時間后，兩種細(xì)胞的caspase3 和Nrf2 表達(dá)水平隨CAP 處理時間的增加，呈逐漸上升趨勢（圖7、8），提示CAP 可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且與氧化應(yīng)激有關(guān)。

圖5 CAP處理后Hela細(xì)胞的凋亡情況Fig.5 Apoptosis rate of Hela cells after CAP treatment

圖6 CAP處理后U87細(xì)胞的凋亡情況Fig.6 Apoptosis rate of U87cells after CAP treatment

3 討論

已有的研究表明，CAP 對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，如：將小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分別用CAP 處理30、60 和120 s，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞代謝活性和細(xì)胞活力明顯下降，凋亡顯著增加，處理后7 d 的細(xì)胞持續(xù)顯示腫瘤生長抑制作用［12］，用20 kV 的CAP 處理U87 和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞E6/E7 后發(fā)現(xiàn)，U87 的凋亡率是E6/E7的3倍［12］。Conway等［13］發(fā)現(xiàn)120 kV，50 Hz的冷等離子體能夠降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U373和宮頸癌細(xì)胞系Hela 的活力，并且其抑制作用與冷等離子體處理時間呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Hela 細(xì)胞較U373 細(xì)胞更為敏感。本研究結(jié)果顯示，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 和宮頸癌細(xì)胞Hela 經(jīng)CAP 處理后，兩種細(xì)胞的活力均顯著下降，且與處理時間有關(guān)，Hela 細(xì)胞在處理30 s后其活力即發(fā)生顯著降低，而U87細(xì)胞在CAP處理60 s后活力才顯著下降，說明兩種腫瘤細(xì)胞對CAP 的敏感性有一定的差異性，Hela 細(xì)胞較U87細(xì)胞更為敏感，結(jié)果與Conway 等［13］的發(fā)現(xiàn)具有類似性。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，經(jīng)CAP 處理60 s 后24 h，兩種腫瘤細(xì)胞的凋亡率都明顯上升，同時伴有caspase3蛋白的表達(dá)增加。caspase3是凋亡過程中的關(guān)鍵剪切酶，其表達(dá)水平隨著CAP 處理時間的增加而增加，表明CAP 處理時間越長，凋亡發(fā)生率越高。

圖7 Hela細(xì)胞經(jīng)CAP處理后Western Blot（a）檢測caspase3（b）和Nrf2（c）的蛋白表達(dá)變化Fig.7 Results of western blot(a)in Hela cells after CAP treatment and the expression levels of caspase3 protein(b)and Nrf2 protein(c)

圖8 U87細(xì)胞經(jīng)CAP處理后Western Blot（a）檢測caspase3（b）和Nrf2（c）的蛋白表達(dá)變化Fig.8 Results of Western blot(a)in U87 cells after CAP treatment and the expression levels of caspase3 protein(b)and Nrf2 protein(c)

文獻(xiàn)報道和本研究的結(jié)果顯示，CAP 對腫瘤細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，但是具體作用機制尚不明確。據(jù)報道，CAP 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因，一方面，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)由于ROS 過度消耗而失衡，另一方面過量的ROS 可能導(dǎo)致細(xì)胞DNA 和線粒體損傷，最終引起細(xì)胞損傷［14-16］，而Nrf2蛋白是氧化應(yīng)激通路的關(guān)鍵分子［17-18］，本研究結(jié)果顯示，兩種腫瘤細(xì)胞經(jīng)CAP 處理后，Nrf2的表達(dá)顯著增加，提示CAP可能通過影響細(xì)胞的氧化應(yīng)激系統(tǒng)發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。我們的結(jié)果與Li等［19］的報道結(jié)果一致。

上述研究結(jié)果表明，本實驗條件下的CAP 能夠有效抑制人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞和宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其機制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。Hela細(xì)胞較U87細(xì)胞對CAP更為敏感。