張銀嬌，賈金榮，龍小慧，林麗玉，陳步信，龍雪微

腹瀉病是我國(guó)兒童最常見(jiàn)的疾病之一，輕癥者僅有大便性狀改變和大便次數(shù)增多等消化道癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂、脫水、全身中毒癥狀等并發(fā)癥，是嬰幼兒主要的致死原因之一[1]。但小兒在服藥及靜脈輸液等方面均存在一定的困難，中藥穴位貼敷療法運(yùn)用方便，能免去上述困難，且成本低，在臨床上也取得明顯良效。本研究通過(guò)觀察穴位貼敷治療小兒急性腹瀉的臨床療效及對(duì)腸道菌群的檢測(cè)分析，初步闡明穴位貼敷治療對(duì)急性腹瀉小兒腸道菌群的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年8月至2019年12月在我院就診治療的急性腹瀉小兒194例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組98例和觀察組96例。兩組患兒在性別、年齡、體質(zhì)量、病程、大便次數(shù)及病情的嚴(yán)重程度方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2 急性腹瀉的診斷及病情分類標(biāo)準(zhǔn)[2-3]

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)大便次數(shù)≥3次/天，較平時(shí)增多；(2)大便性狀改變：呈水樣便、稀爛便、黏液樣便或膿血樣便；(3)病程<2周。

1.2.2 病情分類 (1)輕型：無(wú)脫水等相關(guān)腹瀉并發(fā)癥的表現(xiàn)。(2)中型：有輕度中毒或輕、中度脫水等相關(guān)腹瀉并發(fā)癥表現(xiàn)。(3)重型：有重度脫水或明顯中毒(體溫不升或高熱、甚至驚厥、面色蒼白、煩躁、精神萎靡、嗜睡、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高等)相關(guān)腹瀉并發(fā)癥表現(xiàn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)及病情分類為輕、中型者；(2)年齡6個(gè)月至3周歲；(3)納入研究前告知并獲得法定監(jiān)護(hù)人知情同意，能配合門(mén)診或電話隨訪。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)有過(guò)敏史、局部粘貼的穴位有濕疹或其他皮膚病不適合穴位貼敷者；(2)就診前1周內(nèi)已開(kāi)始應(yīng)用益生菌等腹瀉相關(guān)藥物治療者。

1.5 治療方法 對(duì)照組：口服蒙脫石散及對(duì)癥支持，如建議積極通過(guò)口服補(bǔ)充液體，如有脫水及電解質(zhì)紊亂，及時(shí)予靜脈補(bǔ)液，并給予專業(yè)的合理喂養(yǎng)指導(dǎo)。觀察組：根據(jù)對(duì)照組治療方法加用中藥穴位貼敷治療。穴位選?。荷耜I、天樞、中脘、脾俞。中藥選?。喝夤?、干姜、蒼術(shù)、吳茱萸、木香、石榴皮；由本院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)置磨成粉末，制成小藥餅(直徑1 cm、厚度0.5 cm左右)，將藥餅固定敷到相應(yīng)穴位，每日1次，1次2 h。兩組治療療程均為3 d。

1.6 觀察指標(biāo) 在開(kāi)始治療前、治療期間每日均由專人記錄患兒大便性狀、大便次數(shù)、尿量、食欲及精神等臨床癥狀，并填寫(xiě)臨床癥狀調(diào)查問(wèn)卷；留取糞便標(biāo)本應(yīng)用細(xì)菌的16S rRNA熒光PCR方法檢測(cè)其乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌的含量，通過(guò)計(jì)算B/E(雙歧桿菌/腸桿菌)比值，由此來(lái)評(píng)估腸道定植抗力情況。

1.7 標(biāo)本的采集與PCR檢測(cè)

1.7.1 標(biāo)本的采集 在兩組研究對(duì)象開(kāi)始治療前及治療3 d后分別采集兩組患兒的糞便標(biāo)本，取自然排出的新鮮糞便5 g左右置于密閉的無(wú)菌離心管中，統(tǒng)一置于-80 ℃冰箱備用。

1.7.2 PCR引物及探針設(shè)計(jì)與合成 在BLAST基因庫(kù)內(nèi)查找各細(xì)菌的16S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)合成乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌種特異性引物和探針(蘇州晶科生物科技有限公司合成)，與基因庫(kù)比對(duì)探針和引物的特異性。

1.7.3 細(xì)菌DNA的提取 取凍存的糞便標(biāo)本復(fù)融，電子天平稱取1 g標(biāo)本，使用QIAampDNA stool Mini Kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取糞便標(biāo)本內(nèi)的細(xì)菌DNA，總DNA濃度使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.7.4 熒光定量PCR擴(kuò)增條件 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；所有實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對(duì)照，每個(gè)樣本均有3個(gè)平行復(fù)孔；所有RT-PCR反應(yīng)在Light-Cycle 480上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)得到的擴(kuò)增曲線、溶解曲線分析產(chǎn)物的特異性，標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)不同稀釋梯度DNA的循環(huán)閾值制作而成。

1.8 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《兒科疾病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]。(1)治愈:治療72 h內(nèi)全身癥狀消失，糞便性狀恢復(fù)正常、次數(shù)正常；(2)好轉(zhuǎn):治療72 h時(shí)全身癥狀明顯改善，糞便性狀明顯好轉(zhuǎn)及次數(shù)明顯減少；(3)無(wú)效:治療72 h時(shí)全身癥狀無(wú)好轉(zhuǎn)甚至惡化，糞便性狀無(wú)好轉(zhuǎn)，次數(shù)無(wú)減少。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較 觀察組治愈率高于對(duì)照組，兩組總體療效比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組臨床療效比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，U=2.13，P<0.05。

2.2 兩組治療前后腸道菌群及B/E值比較 見(jiàn)表3。

表3 兩組治療前后腸道菌群及B/E值比較

注：與對(duì)照組比較，at=2.22，2.28，2.42，5.67，P<0.05。

表3結(jié)果表明，兩組治療前留取糞便標(biāo)本進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)，其雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌的含量及B/E值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后菌群檢測(cè)結(jié)果提示觀察組雙歧桿菌及乳酸桿菌含量及B/E值高于對(duì)照組，腸桿菌含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組腸球菌含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

研究表明，大約有1 000種微生物群在人體腸道內(nèi)定植，定植的細(xì)菌總量更是多達(dá)1014個(gè)，是人體細(xì)胞總數(shù)的10倍以上[5]。根據(jù)細(xì)菌對(duì)宿主的作用人體腸道內(nèi)的細(xì)菌可分為共生菌、條件致病菌、致病菌，其中共生菌是腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，占腸道微生物的99%以上，主要由厭氧菌、兼性厭氧菌構(gòu)成，如雙歧桿菌、乳桿菌和擬桿菌，它們共同參與了人體各種重要生理過(guò)程，如食物分解、免疫調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)和新陳代謝等等；而條件致病菌在腸道內(nèi)數(shù)量也比較多，以兼性厭氧菌為主，如腸桿菌、腸球菌等，在正常情況下它們能與共生菌達(dá)成生態(tài)平衡，但在腸道菌群紊亂時(shí)便會(huì)出現(xiàn)大量生長(zhǎng)及增殖，打破這種生態(tài)平衡而成為致病菌[6-7]。在臨床上小兒腹瀉病可由多種原因引起，雖然不同致病菌引起的腹瀉各有其不一樣的臨床特點(diǎn)和過(guò)程，但是均存在程度不同的腸道微生態(tài)環(huán)境失衡。發(fā)生腹瀉時(shí)，人體腸道的內(nèi)環(huán)境會(huì)發(fā)生變化，嬰幼兒的變化則更為明顯，正常微生物菌群賴以生存的環(huán)境被破壞了，正常菌群數(shù)量會(huì)出現(xiàn)減少，而條件致病菌數(shù)量則不斷地增長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為腸桿菌增加，而雙歧桿菌、乳酸桿菌等優(yōu)勢(shì)菌均顯著減少，這種菌群微生態(tài)失衡將進(jìn)一步加重腹瀉癥狀，使兩者之間形成一種惡性循環(huán)[8]。因此糾正腸道菌群失調(diào)是治療腹瀉的基本條件及必要治療措施。在臨床治療上，通過(guò)積極恢復(fù)人體腸道菌群微生態(tài)環(huán)境的平衡，可以形成一個(gè)抑制致病菌生長(zhǎng)、有利于腸道功能正常發(fā)揮的良好狀態(tài)。腸道菌群微生態(tài)的平衡是腸道黏膜形成生物屏障的一個(gè)重要因素，研究證實(shí)它也影響著腸道的其他功能，如機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障等，腸道的各種屏障功能可以防止微生物及其產(chǎn)物、食物抗原及有害大分子物質(zhì)穿過(guò)腸黏膜[9]，從而起到防治腹瀉的作用。

雙歧桿菌、乳桿菌等腸道固有菌通過(guò)生態(tài)平衡、生物拮抗、免疫作用及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等多種途徑發(fā)揮防治腹瀉的作用。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌數(shù)量與腸黏膜厚度及絨毛高度呈正相關(guān)，B/E值與回腸黏膜厚度和絨毛高度正相關(guān)，表明以雙歧桿菌為代表的厭氧菌在維系腸黏膜結(jié)構(gòu)完整方面發(fā)揮重要作用[10-11]。雙歧桿菌和乳酸桿菌的定植抗力能調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，有效抑制損害腸道功能和誘發(fā)各種疾病的有害致病菌的生長(zhǎng)，維護(hù)腸道生物屏障的完整及腸道微生態(tài)的平衡[12-13]；上述兩種菌群還能夠通過(guò)分泌某些抗菌物質(zhì)，并形成化學(xué)屏障，且在體內(nèi)能發(fā)酵糖類，產(chǎn)生醋酸和乳酸等物質(zhì)，使腸內(nèi)處于偏酸環(huán)境，能很好的抑制病原菌生長(zhǎng)和繁殖，達(dá)到減輕腹瀉癥狀的目的；在腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌還可產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，如細(xì)菌素、親脂分子、過(guò)氧化氫和乙醛等等，同時(shí)也可減少腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)，如胺及氨等，也降低了內(nèi)毒素的影響，緩解人體腸道菌群的失調(diào)[14]。雙歧桿菌還可通過(guò)刺激腸道淋巴組織，進(jìn)一步促進(jìn)分泌型IgA的分泌，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫功能，抑制病原菌損傷[15]。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌還可降低腹瀉病例血漿胃泌素和胃動(dòng)素的分泌水平，使腸道黏膜對(duì)水和電解質(zhì)的分泌減少及胃排空和腸蠕動(dòng)減慢，腹瀉癥狀能更快減輕[16]。

小兒腹瀉病主要病機(jī)是脾虛濕盛，中醫(yī)治療以運(yùn)脾化濕止瀉為法。本研究中所選用的藥物為肉桂、干姜、蒼術(shù)、吳茱萸、木香及石榴皮，其中蒼術(shù)燥濕健脾，肉桂、干姜及吳茱萸溫陽(yáng)化濕助運(yùn)，木香化濕和中理氣，石榴皮澀腸止瀉；藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，上述藥物均含有多種揮發(fā)油成分，具有良好的透皮吸收效果與輕微的皮膚刺激作用[17]，可起到藥物透皮吸收和穴位刺激的雙重治療作用。本研究所選用穴位為脾俞、中脘、神闕及天樞，其中脾俞能健脾和胃、利濕升清，中脘能和胃健脾、降逆利水，天樞能振奮腑氣、調(diào)理氣機(jī)，神闕能溫中助運(yùn)健脾。藥物與穴位配合共奏健脾助運(yùn)、化濕止瀉之功效。最近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)刺激大鼠的天樞及足三里等穴位，可改善腹瀉型腸易激綜合征大鼠的腹瀉癥狀，高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其腸道菌群的豐富度及多樣性指數(shù)升高，乳酸桿菌科和雙歧桿菌科的豐度上升[18]。小兒皮膚嬌嫩，對(duì)穴位刺激的敏感性較高，易于接收并傳遞治療信息，將刺激信號(hào)可上傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮迷走神經(jīng)，可提高多種消化酶的活力，調(diào)節(jié)胃腸激素及消化液等物質(zhì)的分泌，使胃腸蠕動(dòng)更加規(guī)律[19]，這些因素都會(huì)對(duì)腸道菌群定植的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生一定影響，從而起到調(diào)整腸道菌群微生態(tài)環(huán)境平衡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)中藥穴位貼敷治療小兒急性腹瀉有確切的臨床療效，能減少大便次數(shù)，改善大便性狀，使腹瀉得到控制，其總體療效及治愈率觀察組均高于對(duì)照組(P<0.05)；而針對(duì)糞便的雙歧桿菌及乳酸桿菌含量檢測(cè)，觀察組治療后也均高于對(duì)照組(P<0.05)，B/E值大于1且明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，提示通過(guò)穴位貼敷治療可提高小兒腸道內(nèi)源性雙歧桿菌、乳酸桿菌專性厭氧菌的含量，腸道定植抗力也得到提高，同時(shí)能有效抑制致病菌或條件致病菌的生長(zhǎng)與繁殖，調(diào)節(jié)平衡了腸道微生態(tài)環(huán)境，從而達(dá)到治療腹瀉的目的。對(duì)在服藥及輸液治療等用藥方面均存在一定困難的小兒患者中，中藥貼敷是一種經(jīng)濟(jì)方便、值得推廣應(yīng)用的療法。