衛(wèi)園園 范晉楠 李亞蕊
膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是新生兒及嬰兒期阻塞性黃疸的主要病因之一,其以肝內(nèi)、肝外膽道閉塞為主要特征,可導(dǎo)致不可控制、迅速發(fā)展的進(jìn)行性肝纖維化,如不及時(shí)治療,患兒常在1 歲內(nèi)死亡[1,2]。 BA 的病因目前仍不清楚,可能與多種因素(如發(fā)育異常、遺傳易感性、血運(yùn)障礙、病毒感染、膽汁酸代謝異常、免疫及炎癥反應(yīng)等)有關(guān)[3,4]。 BA的發(fā)病率有明顯的種族和地區(qū)差異,其中亞洲地區(qū)明顯高于歐美地區(qū)[5,6]。 此外,有研究報(bào)道家庭中數(shù)名BA 患兒,以及母親與孩子同患BA 的文獻(xiàn)[7]。這提示BA 的發(fā)病存在遺傳因素的作用。 Garcia-Barcelo 等[8]于2010 年對中國人群中BA 患兒進(jìn)行了首個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS),發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)與BA 相關(guān)性較大的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn),其中相關(guān)性最強(qiáng)的是rs17095355 位點(diǎn),分析顯示該位點(diǎn)的OR值及其95%CI為1.77 (1.38 ~2.26),增加了BA 的易患性。 rs17095355 位點(diǎn)位于ADD3基因上,胞嘧啶可轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(C >T),隨后在泰國以及其他中國人群中的研究也發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性顯著增加了BA 的易患風(fēng)險(xiǎn),而Tsai 等的研究結(jié)論與上述不同[9-14]。 本研究擬對rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與膽道閉鎖相關(guān)性研究進(jìn)行Meta 分析,為膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制提供線索。
檢索的數(shù)據(jù)庫包括英文數(shù)據(jù)庫(PubMed、EMbase、Web of Science)及中文數(shù)據(jù)庫(中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、維普期刊資源整合服務(wù)平臺和中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng))。 檢索時(shí)間截至2019 年7 月。 英文檢索詞:“biliary atresia”O(jiān)R“bile duct atresia ”、 “ rs17095355 ” OR “ ADD3 ” OR“XPNPEP1”、“polymorphism”O(jiān)R“genetic variant”O(jiān)R“genetic variation”等。 中文檢索詞:“膽道閉鎖”、“rs17095355 或ADD3 或XPNPEP1”、“多態(tài)性”等。
納入標(biāo)準(zhǔn): ①人群研究或病例對照研究; ②研究內(nèi)容包括rs17095355 位點(diǎn)與膽道閉鎖相關(guān)性; ③語種為中文或英文; ④能夠提供各個(gè)等位基因在病例組和對照組中的頻數(shù)分布用于計(jì)算比值比(odds ratio,OR)。 排除標(biāo)準(zhǔn): ①不能提供完整數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)存在明顯錯(cuò)誤的文獻(xiàn); ②通信、綜述、病例報(bào)道、會議摘要、期刊述評、專家意見; ③未設(shè)立對照組。 閱讀標(biāo)題和摘要,依據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步篩選,排除不符合要求的文獻(xiàn),通讀入選文獻(xiàn)后進(jìn)行再次篩選。
對納入文獻(xiàn)使用自擬提取表提取資料,提取信息包括文獻(xiàn)特征(第一作者姓名、發(fā)表年份、研究人群等)以及病例組與對照組的例數(shù)、等位基因頻率等。 采用紐卡斯?fàn)?渥太華(Newcastle-Ottawa scale,NOS)量表對納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),內(nèi)容包括: ①研究人群選擇:診斷是否明確(1 分),病例是否具有代表性(1 分),對照來源(1 分),對照確定(1 分);②組間可比性:設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析時(shí)考慮病例組和對照組的可比性(2 分); ③暴露因素測量:暴露因素確定(1 分),暴露是否采用相同檢測方法(1 分),無應(yīng)答率(1 分)。 總分9 分,5 分以上可視為高質(zhì)量文獻(xiàn)。 整個(gè)過程由兩位評價(jià)者獨(dú)立完成,不一致處經(jīng)討論后決定。
數(shù)據(jù)分析采用Stata 14.0 軟件。 應(yīng)用Q 檢驗(yàn)法(χ2檢驗(yàn))對所納入的研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn),同時(shí)計(jì)算I2統(tǒng)計(jì)量,以P≤0.1 為存在異質(zhì)性。 當(dāng)同時(shí)滿足P>0.1 和I2≤40%時(shí),采用固定效應(yīng)模型,反之則采用隨機(jī)效應(yīng)模型[15]。OR值計(jì)算方法為實(shí)驗(yàn)組中某等位基因或基因型與其它等位基因或基因型之比除以對照組之比,OR=1 提示該因素對疾病的發(fā)生不起作用,95%CI下限>1 提示可能為危險(xiǎn)因素,上限<1時(shí)提示可能為保護(hù)因素,上述結(jié)果均采用Stata 14.0計(jì)算。 假定T 等位基因?yàn)槲kU(xiǎn)基因,分別計(jì)算在等位基因遺傳模型(Tvs.C)、顯性基因遺傳模型(TT+CTvs.CC)、隱性基因遺傳模型(TTvs.CT +CC)下的合并OR值及其95%CI。 并按樣本量大小進(jìn)行亞組分析。 使用在線工具驗(yàn)證對照組基因頻率分布是否符合H-W 遺傳平衡定律。 并逐一剔除每一項(xiàng)研究進(jìn)行敏感性分析。 采用漏斗圖觀察發(fā)表偏倚,并用Egger's檢驗(yàn)評價(jià)漏斗圖的對稱性,P>0.1 時(shí)可判斷漏斗圖對稱,無明顯發(fā)表偏倚。
共檢索到2019 年7 月以前發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)33篇,剔除重復(fù)文獻(xiàn)后獲得12 篇,其中綜述3 篇,其它基因1 篇,研究對象非人群1 篇。 排除上述不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn),最終納入7 篇文獻(xiàn),見圖1。
圖1 文獻(xiàn)檢索納入排除流程圖Fig.1 Flow diagram of study selecting
7 篇文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間為2010—2018 年,共包括8組獨(dú)立樣本研究(Garcia-Barcelo 等2010 年的研究中包括兩組獨(dú)立樣本),均為病例對照研究。 7 組研究對象為亞洲人群[8-13],1 組研究對象為高加索人[14]。 納入文獻(xiàn)中有2 篇樣本量≥1 000 例[12,14];3篇文獻(xiàn)明確提及采用通用診斷標(biāo)準(zhǔn)[12-14],2 篇文獻(xiàn)中為已行Kasai 手術(shù)患兒[10,11];所有文獻(xiàn)對照組基因分布均符合H-W 遺傳平衡定律;SNP 檢測方法包括Sanger 直接測序法、Taqman 探針法、基因芯片法;4 篇文獻(xiàn)對照組來源于健康人群[9-11,14]。 所納入文獻(xiàn)NOS 評分均>5 分。 入選文獻(xiàn)基本特征、質(zhì)量評價(jià)及rs17095355 位點(diǎn)等位基因分布情況見表1。
表1 入選文獻(xiàn)基本特征和NOS 評分及rs17095355 位點(diǎn)等位基因分布情況Table 1 Major characteristics and quality evaluations of eligible studies and the distribution of rs17095355
Meta 分析結(jié)果顯示,等位基因遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與膽道閉鎖患病風(fēng)險(xiǎn)的合并OR值及95%CI為1.66(1.44 ~1.90),見圖2。 亞洲人群中等位基因遺傳模型下該位點(diǎn)多態(tài)性與膽道閉鎖患病風(fēng)險(xiǎn)的合并OR值及95%CI為1.72(1.48 ~1.99),見圖3。 對所有研究按樣本量大小是否≥1 000 人進(jìn)行亞組分析后,異質(zhì)性減少。 在樣本量<1 000 人組和樣本量≥1 000 人組中,該位點(diǎn)均增加了BA 的易患性,合并OR值及95%CI分別為1.84 (1.63 ~2.07)和1.32(1.16 ~1.50),見圖4。 其中4 組研究提供了BA 組與對照組具體的基因型分布例數(shù)[10-13],見表2。 在顯性基因遺傳模型(TT+CTvs.CC)、隱性基因遺傳模型(TTvs.CT +CC)下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性均使膽道閉鎖的患病風(fēng)險(xiǎn)增加,OR值及95%CI分別為1.66(1.38 ~2.01)和2.16(1.38 ~3.37),見表3。
逐個(gè)去掉任何一項(xiàng)研究,對等位基因模型下rs17095355 位點(diǎn)基因多態(tài)性與膽道閉鎖關(guān)聯(lián)性研究的Meta分析結(jié)果進(jìn)行敏感性分析,發(fā)現(xiàn)對合并OR值的影響不大(圖5)。
圖2 等位基因遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與BA 關(guān)聯(lián)的森林圖Fig.2 Forest plots of rs17095355 polymorphism and BA in allele genetic model
圖3 亞洲人群中等位基因遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與BA 關(guān)聯(lián)的森林圖Fig.3 Forest plots of rs17095355 polymorphism and BA in allele genetic model in Asian populations
圖4 按樣本量大小進(jìn)行亞組分析后等位基因遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與BA 關(guān)聯(lián)的森林圖Fig.4 Forest plots of rs17095355 polymorphism and BA in allele genetic model by subgroup analysis
表2 BA 組與對照組基因型分布情況(n)Table 2 The distribution of genotypes in four studies(n)
表3 不同遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)與膽道閉鎖的關(guān)聯(lián)Table 3 Meta-analysis of rs17095355 polymorphism and biliary atresia risk
圖5 敏感性分析Fig.5 Sensitivity analysis
對等位基因模型下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與膽道閉鎖關(guān)聯(lián)性研究的Meta 分析采用Egger's 檢驗(yàn)進(jìn)行發(fā)表偏倚的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)存在發(fā)表偏倚(t=2.72,P=0.035)。
膽道閉鎖的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確,包括遺傳因素、血運(yùn)障礙、病毒感染、膽汁酸代謝異常、免疫及炎癥反應(yīng)等多種因素[3,4]。 單核苷酸多態(tài)性是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占基因多態(tài)性的80%以上。 基于對BA 發(fā)病機(jī)制的探索和對遺傳學(xué)認(rèn)識的深入,以及基因分型技術(shù)的發(fā)展,越來越多的學(xué)者關(guān)注著基因、SNP 與BA 之間的關(guān)系,進(jìn)行了諸多尋找和驗(yàn)證BA 易感基因的研究[8-14]。 本次Meta 分析納入了7 篇關(guān)于rs17095355位點(diǎn)多態(tài)性與BA 相關(guān)性的文獻(xiàn),共包括8 組獨(dú)立樣本研究。 其中1 組研究對象為高加索人,剩余7組均為亞洲人,包括5 組中國人群研究和2 組泰國人群研究[8-14]。 本Meta 分析結(jié)果顯示,在3 種遺傳模型包括等位基因遺傳模型、顯性基因遺傳模型和隱性基因遺傳模型下,rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性均增加了膽道閉鎖的患病風(fēng)險(xiǎn),OR值及95%CI分別為1.66(1.44 ~1.90)、1.66(1.38 ~2.01)和2.16(1.38 ~3.37)。
8 組研究均采用病例對照研究探討了等位基因遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)與BA 的相關(guān)性。 Garcia-Barcelo 等[8]于2010 年進(jìn)行了首個(gè)基于中國BA患兒的GWAS 研究,篩選出了10 個(gè)與BA 相關(guān)性最強(qiáng)的SNPs,其中就包括10q24.2 區(qū)的rs17095355 位點(diǎn),分析顯示該位點(diǎn)OR值及95%CI為1.77 (1.38~2.26) ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=4.75 ×10-6)。隨后獨(dú)立樣本(124 名BA 患兒和90 名健康兒童)的驗(yàn)證結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)rs17095355 位點(diǎn)與BA 相關(guān)性最強(qiáng),OR值及95%CI為2.13(1.42 ~3.20) ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=6.94 ×10-9)。 此后關(guān)于亞洲人群中該位點(diǎn)與BA 易感性的文獻(xiàn)包括2011 年Kaewkiattiyot 等[10]及2018 年Laochareonsuk 等[11]在泰國人群,以及2013 年Cheng 等[9]、2014 年Zeng等[13]和2018 年Wang 等[12]在中國人群中的研究。其中Wang 等[12]研究總?cè)藬?shù)超過1 000 人,計(jì)算的OR值及95%CI為1.33(1.15 ~1.54) ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.60 ×10-4),相較其他研究稍低。 本Meta 分析計(jì)算顯示亞洲人群中該位點(diǎn)在等位基因遺傳模型下的合并OR值及95%CI為1.72(1.48 ~1.99),與大部分研究結(jié)果相近。 考慮到納入研究中僅1 組針對高加索人,其余均為亞洲人群的研究,故未對種族進(jìn)行亞組分析。 唯一以高加索人為研究對象的數(shù)據(jù)來自Tsai 等,該研究總樣本量超過1 000人,包括171 名BA 患兒與1 630 名對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs7099604 為10q24.2 區(qū)與BA 相關(guān)性最強(qiáng)的SNP 位點(diǎn),OR值及95%CI為1.45(1.09 ~1.92),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=2.46 ×10-3),而非rs17095355 位點(diǎn),OR值及95%CI為1.29(0.98 ~1.71),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=2. 65 × 10-2),不同于亞洲人群[14]。 已知BA 發(fā)病率存在種族差異[5,6],亞洲國家可達(dá)歐美國家的兩倍[16]。 亞洲人群與高加索人群中rs17095355 位點(diǎn)OR值的差異可能與此因素有關(guān)[14]。 7 篇文章中4 篇提供了BA 組與對照組的基因型分布情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在顯性基因遺傳模型、隱性基因遺傳模型下rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性均使膽道閉鎖的患病風(fēng)險(xiǎn)增加,但納入研究數(shù)量較少,結(jié)果的可信度受到限制[10-13]。 考慮到該類研究中由于某些基因較低或較高的最小等位基因頻率(minimal allele frequency,MAF)值及樣本量的不足等因素很容易出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的假陽性、假陰性,因此本研究以樣本量大小是否超過1 000 人對研究規(guī)模進(jìn)行了亞組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組中該位點(diǎn)均增加了BA的易感性,而異質(zhì)性減少,提示樣本量可能是異質(zhì)性的來源。 因此,更可靠的結(jié)果有待不同種族中更多樣本量大、數(shù)據(jù)詳細(xì)的研究來驗(yàn)證。
值得注意的是,目前對SNP 的研究不僅集中在疾病易感性,隨著認(rèn)識的深入,越來越多的研究也開始關(guān)注SNP 對基因功能的影響與疾病的關(guān)系[17,18]。 rs17095355 位點(diǎn)位于10q24 區(qū)的ADD3基因上,同樣位于該區(qū)XPNPEP1基因的上游。ADD3基因編碼一種膜骨架蛋白即內(nèi)收蛋白3,可促進(jìn)肝臟、膽道上皮細(xì)胞細(xì)胞間連接、黏附,調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移及黏附,而膽小管細(xì)胞的收縮需要肌動蛋白-肌球蛋白相互作用,若該機(jī)制障礙可出現(xiàn)膽汁淤積[19]。XPNPEP1表達(dá)于肝膽上皮細(xì)胞中,編碼氨肽酶P1,該酶特異性地催化N 端與倒數(shù)第二位脯氨酸相連氨基酸的裂解,參與膽汁酸的代謝、分泌及炎癥過程[10]。 免疫組化研究顯示,XPNPEP1在膽道上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞中都有表達(dá),而ADD3 特異性地表達(dá)于膽道上皮細(xì)胞中,在肝細(xì)胞中很少或不表達(dá)[14]。 此外,有研究者發(fā)現(xiàn),XPNPEP1基因敲除的斑馬魚很少或不發(fā)生膽道異常,但在ADD3敲除后可存在肝內(nèi)膽道結(jié)構(gòu)的缺陷[14]。 關(guān)于rs17095355位點(diǎn)多態(tài)性是否影響ADD3或XPNPEP1基因的功能,數(shù)名研究者進(jìn)行了探討[8-10,14]。 Garcia-Barcelo等[8]通過生物信息學(xué)分析(Genomatix suite)發(fā)現(xiàn),rs17095355 位點(diǎn)的C >T 改變了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor binding sites,TFBSs),然而這一轉(zhuǎn)換對包含該位點(diǎn)及其周圍的序列并無功能學(xué)影響。 Tsai 等[14]采用qPCR 法檢測正常對照、肝內(nèi)膽汁淤積和BA 肝臟中XPNPEP1和ADD3的表達(dá),三組患者XPNPEP1表達(dá)無差異,而BA 與正常對照組之間的ADD3表達(dá)水平有差異(P<0.001)。 Cheng等[9]通過生物信息學(xué)和體內(nèi)基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),與BA 發(fā)病相關(guān)的調(diào)控性SNPs 與ADD3基因在肝臟中的蛋白表達(dá)有關(guān)系,而XPNPEP1則沒有。 這些均提示該位點(diǎn)可能通過影響ADD3的功能表達(dá)在BA發(fā)病中發(fā)揮作用。 大多數(shù)研究并未涉及rs17095355位點(diǎn)與BA 患兒臨床及病理特征是否存在關(guān)系。 僅Kaewkiattiyot 等[10]將BA 患兒分為無黃疸組(TB <2 mg/dL)和持續(xù)黃疸組(TB≥2 mg/dL) ,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間基因型及rs17095355 位點(diǎn)表達(dá)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 rs17095355 多態(tài)性是否以及如何影響ADD3表達(dá),是否與BA 患兒臨床特征及病理特點(diǎn)存在關(guān)系,還需要進(jìn)一步探索。
本研究存在一定局限性。 ①膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能存在基因-基因、基因-環(huán)境的交互作用。 研究者們還對rs2501577、rs10509906 等SNP位點(diǎn)與膽道閉鎖患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行了分析,并發(fā)現(xiàn)了一些具有意義的單體型,鑒于其它位點(diǎn)的意義及相關(guān)研究數(shù)量有限,本研究只針對rs17095355位點(diǎn)進(jìn)行了分析。 此外,有學(xué)者認(rèn)為膽道閉鎖是在遺傳學(xué)背景的基礎(chǔ)上,在環(huán)境因素作用下誘發(fā)的異常免疫反應(yīng)[20,21]。 有報(bào)道異卵或同卵雙胞胎中只有1 人患BA 的情況,但目前關(guān)于膽道閉鎖的基因多態(tài)性研究中普遍缺乏病毒感染等環(huán)境因素資料。②本研究檢索了幾個(gè)主要的中英文數(shù)據(jù)庫,未包括其他語言撰寫的文獻(xiàn),使納入研究的全面性受到了一定影響。 日本膽道閉鎖發(fā)病率相對較高,但所檢索文獻(xiàn)除中國、泰國外,無亞洲其他國家的相關(guān)研究數(shù)據(jù),不能揭示亞洲其他國家rs17095355 位點(diǎn)基因多態(tài)性與膽道閉鎖的關(guān)系。 本研究的相關(guān)結(jié)果尚需在亞洲其他國家,以及美洲、歐洲等開展嚴(yán)格設(shè)計(jì)的病例對照或前瞻性研究加以驗(yàn)證。 ③一般認(rèn)為BA 可分為兩大類型:胚胎型(先天型)和圍生期型(獲得型),兩者發(fā)病機(jī)制有所不同。 納入文獻(xiàn)中約50%作者未注明膽道閉鎖類型[10-12,14]。 膽道閉鎖女孩多于男孩,但納入文獻(xiàn)無充足數(shù)據(jù)對性別進(jìn)行亞組分析。 4 篇文獻(xiàn)提供了數(shù)據(jù)用于在顯性模型及隱性模型下進(jìn)行比較,但樣本數(shù)量較少。 ④Cochrane 手冊中認(rèn)為在納入研究數(shù)量少于10 個(gè)時(shí),Egger 檢驗(yàn)的效能和敏感性都受到限制,本研究在全面檢索后納入8 組研究,此時(shí)檢驗(yàn)效能受到限制,因此盡管Egger 檢驗(yàn)提示發(fā)表偏倚,本研究結(jié)果仍有參考價(jià)值。
總之,Meta 分析發(fā)現(xiàn)rs17095355 位點(diǎn)多態(tài)性與膽道閉鎖患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),T 等位基因可能是發(fā)生膽道閉鎖的危險(xiǎn)因素,特別是在亞洲人群中。 然而以上結(jié)果仍需要來自亞洲其他地區(qū)以及美洲、歐洲等不同種族的更大規(guī)模的研究來將現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫建立得更加的龐大、豐富。 此外,rs17095355 位點(diǎn)是否以及如何影響相關(guān)基因的表達(dá)及功能,是否與BA患兒臨床及病理特征存在關(guān)聯(lián),還需要進(jìn)一步研究。