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（1 錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院解剖學教研室，2 遼寧省神經(jīng)退行性病變重點實驗室，錦州 121000）

丙烯酰胺（acrylamide，AA）和2，5-己二酮（2，5-hexanedione，2，5-HD）對機體均可產(chǎn)生神經(jīng)毒作用，它們對機體產(chǎn)生的病理改變和作用機制可能不同。AA 是一種水溶性不飽和酰胺，AA有機合成類職業(yè)暴露人群流行病學研究確定的癥狀是中樞和周圍神經(jīng)損傷[1-2]，包括共濟失調(diào)、步態(tài)異常、后肢麻木和骨骼肌變?nèi)醯萚3]。2，5-HD 是正己烷在機體的代謝產(chǎn)物，研究表明神經(jīng)系統(tǒng)是 2，5-HD 的主要靶標，早期接觸出現(xiàn)手腳麻木和刺痛，接著會出現(xiàn)虛弱和反射消失，更嚴重的會引起步態(tài)異常[4-5]。研究表明AA 等毒素暴露下大鼠神經(jīng)軸突出現(xiàn)轉運障礙，神經(jīng)纖維絲聚集，這種病變主要累及較長的軸突如坐骨神經(jīng)，而這種軸突腫脹在薄束核也被觀察到[6]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶（NADPH-d）組織化學常被用來顯示一氧化氮合酶（NOS）陽性神經(jīng)元，在老年鼠和鴿子延髓節(jié)段均發(fā)現(xiàn)有年齡相關性NADPH-d 染色的陽性改變[7]，全身并且局部坐骨神經(jīng)給予2，5-HD 的正常Zucker lean 大鼠，在薄束核NADPH-d 染色神經(jīng)元和軸突增加[8]。但是對于亞急性毒素暴露后大鼠薄束核的病理改變及其機制目前還未見報道，本實驗旨在探究AA 和2，5-HD 對薄束核的病理改變的差異性影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 周齡的SPF 級雄性SD 大鼠48 只（均購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心）。飼養(yǎng)于明/暗12 h/12 h 循環(huán)的動物房，濕度適宜，動物可自由取食水。

1.2 主要試劑和儀器

AA、2，5-HD、β-NADPH-d、氯化硝基四氮唑藍（nitro blue tetrazolium，NBT）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和降鈣素基因相關肽（CGRP）均為Sigma；胎牛血清（北京索萊寶）；ABC 試劑盒（ABC kit，美國Vector）；DAB 試劑盒（北京中山金橋）。CM1950 冰凍切片機（德國Leica）；BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus）；曠場系統(tǒng)設備（安徽正華生物）。

1.3 動物模型制備與分組

將48 只雄性SD 大鼠隨機分為對照組、AA 組和2，5-HD 組，每組16只。AA和2，5-HD以生理鹽水為溶劑進行配置，AA 組和2，5-HD 組每次給藥劑量分別為AA（25 mg/kg）和2，5-己二酮（300 mg/kg），以腹腔注射方式，每周周一至周五17 點給藥，每天給藥1 次，連續(xù)給藥10 周以建立亞急性中毒模型，對照組給予等容積的生理鹽水。每周周末記錄體質量，根據(jù)體質量變化調(diào)整下周給藥劑量。

1.4 步態(tài)評分

將大鼠置于黑色背景的寬闊平臺上，放松后使其自由活動，觀察3 min，拍照、錄像并進行步態(tài)評分。觀測分值在1～4 之間，1 分=正常步態(tài)；2分=輕度異常步態(tài)（輕微共濟失調(diào)，步態(tài)比較吃力，出現(xiàn)足外展）；3 分=中度異常步態(tài)（有明顯的共濟失調(diào)，足部伸展，行走時肢體外展）；4 分=重度異常步態(tài)（出現(xiàn)足外展，整個身體無力支撐，腹部著地）[9]。

1.5 曠場實驗

運動活躍度觀察采用曠場實驗測試。正式實驗之前，先將待測動物移入實驗箱內(nèi)，使其適應測試環(huán)境2 d。實驗過程為：將大鼠分別置于黑色有機玻璃測試裝置（50 cm×50 cm×40 cm）中，記錄5 min，記錄參數(shù)包括總路程、平均速度，活躍度等參數(shù)[10]。

1.6 組織取材及切片制備

實驗用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉動物，打開胸腔，經(jīng)左心室插管入升主動脈，先用300 mL 室溫的生理鹽水心內(nèi)灌流，然后用4℃的含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）進行灌流固定。在冰盒上迅速取出腦干，置于含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 中固定8 h，然后移至25%的蔗糖溶液中24 h。對腦干做連續(xù)冠狀切片（40 μm），收集在盛有PBS 的12 孔板的3個孔中，連續(xù)循環(huán)收集組織切片，薄束核切片進行NADPH-d 組織化學顯色，GFAP 和CGRP 免疫組織化學顯色。

1.7 NADPH-d 組織化學顯色及半定量分析

每組動物隨機選8 只用于NADPH-d 組織化學實驗，用上述收集到的某一孔的全部薄束核節(jié)段的冠狀切片于24 孔板中，用含有0.3% Triton X-100的PBS 溶液漂洗3 次，在冰上操作。切片放在含有0.3%Triton X-100，1 mg/mL NADPH-d，1 mg/mL NBT 的溶液中37℃孵育1.5～2.5 h。顯微鏡下觀察控制染色深度，用PBS 溶液洗滌切片，適時終止反應[11]。染色后切片貼于明膠載玻片上，進行常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。每只大鼠隨機挑選4 張具有典型薄束核結構的切片，在光學顯微鏡下觀察，統(tǒng)計薄束核區(qū)域全部的NADPH-d 的陽性神經(jīng)元個數(shù)和NADPH-d 陽性小體個數(shù)，并做測量和拍照。

1.8 GFAP 和CGRP 免疫組織化學顯色

每只動物取4 張薄束核節(jié)段切片，用PBS 溶液漂洗3 遍，經(jīng)3%過氧化氫滅活、3%胎牛血清封閉 2 h，加入小鼠源性GFAP 一 抗（1∶1 500）和CGRP 一抗（1∶200），另取少部分切片用3%胎牛血清替代一抗作陰性對照，4℃過夜。吸出一抗，PBS 溶液漂洗3 遍后加入生物素化羊抗小鼠IgG（1∶200），室溫孵育45 min。吸出孵育液，PBS 溶液漂洗3 遍，加入ABC 復合物（1∶100，提前30 min 配制）室溫孵育1 h，用PBS 溶液漂洗終止反應。加入DAB 顯色液，反應3～5 min，顯微鏡下觀察并適時用雙蒸水終止反應，貼片、脫水、透明、封片。在20 倍物鏡下，每張切片在薄束核中間區(qū)域選取4個視野，用Image J 軟件測量陽性反應面積，計算均值，將均值作為該切片的陽性反應面積，并拍照。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。Image J軟件分析免疫組織化學結果，用陽性反應面積率表示。所有實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，各組計量資料與對照組比較均用t檢驗。

2 結果

2.1 毒素對大鼠體質量及行為學的影響

AA 組大鼠的體質量從給藥3 周后增長變緩，5 周后與對照組相比體質量下降明顯（P＜0.01）。2，5-HD 組大鼠體質量2 周后開始增長變緩，3 周后體質量下降（P＜0.05），5 周后體質量明顯低于對照組（P＜0.01）（圖1）。實驗過程中，2，5-HD 組的個別鼠在第5 周出現(xiàn)極度消瘦直至死亡的現(xiàn)象，根據(jù)以往文獻報道，本實驗藥物劑量能引起大鼠代謝異常甚至死亡。步態(tài)評分結果顯示，AA 組大鼠從4 周開始出現(xiàn)步態(tài)評分異常（P＜0.01），給藥8周后出現(xiàn)重度步態(tài)異常（P＜0.01），雙足外翻，腹部著地。而2，5-HD 大鼠在第3 周開始出現(xiàn)步態(tài)異常，4 周后出現(xiàn)重度步態(tài)異常（P＜0.01），5 周后全部出現(xiàn)重度步態(tài)異常，雙足間距增寬，后腳掌外翻，腹部著地拖行（圖1）。大鼠暴露于AA 和 2，5-HD 后，均出現(xiàn)了嚴重的運動功能損傷，曠場實驗結果顯示，與對照組相比，AA 組大鼠5 min總路程明顯偏短（P＜0.01），活躍度減低（P＜0.01）。2，5-HD 組大鼠5 分鐘總路程與對照組比較也明顯縮短（P＜0.01），活躍度降低（P＜0.01），有些甚至完全失去行走能力（圖1）。

圖1 體質量與行為學測量Fig1 Measurement of body mass and behavior after AA and 2，5-HD intraperitonealy injection.

2.2 毒素對大鼠薄束核區(qū)NADPH-d 組織化學反應的影響

大鼠薄束核NADPH-d 組織化學顯色結果表明，與對照組相比，AA 組薄束核區(qū)NADPH-d 陽性神經(jīng)元明顯增加（P＜0.01），NADPH-d 陽性星形膠質細胞增多，背景染色較深。另外，在AA 組，異常的NADPH-d 陽性體與對照組相比也明顯增多（P＜0.05）。2，5-HD 組與對照組相比，染色背景較深，NADPH-d 陽性神經(jīng)元數(shù)目與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。此外，與對照組和AA 組相比，2，5-HD 組出現(xiàn)明顯的異常NADPH-d 陽性體結構，類圓球形，染色較深，異常陽性體數(shù)目顯著增加（P＜0.01，圖2）。

2.3 毒素對薄束核區(qū)GFAP 和CGRP 表達的影響

GFAP 是星形膠質細胞的特異性標志物。GFAP 免疫組織化學顯示，對照組薄束核只有極少的星形膠質細胞，染色較淺，突起少而纖細，較多的分布在三叉神經(jīng)束和延髓網(wǎng)狀束（圖中未顯示）。與對照組相比，AA 組薄束核區(qū)星形膠質細胞計數(shù)增多，胞體增大而染色加深，突起增多，變粗大，呈網(wǎng)狀，明顯處于活化狀態(tài)，陽性反應面積與對照組相比顯著增加（P＜0.01）。2，5-HD 組與AA 組類似，星形膠質細胞數(shù)明顯增多（P＜0.01），細胞密集，染色深，胞體較大，突起多，星形膠質細胞也處于活化狀態(tài)。CGRP 免疫組織化學顯示陽性染色主要存在于三叉神經(jīng)束（圖中未顯示），各實驗組與對照組在薄束核區(qū)均沒有明顯的陽性反應，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖2 薄束核NADPH-d 組織化學染色。Fig2 NADPH-d histochemical staining of gracilis nucleus.

圖3 薄束核GFAP 和CGRP 免疫組織化學顯色。Fig3 Immunohistochemical staining of GFAP and CGRP in the gracile nucleus.

3 討論

薄束核是接收來自下肢初級感覺神經(jīng)元上行纖維傳入的核團。大鼠注射2 種毒素后均出現(xiàn)后肢運動障礙，這可能與感覺神經(jīng)傳導通路受損有關，本研究結果顯示，這2 種毒素對薄束核產(chǎn)生的病理改變不同。

AA組和2，5-HD組GFAP表達均明顯增多，AA組中GFAP增多比2，5-HD組更加明顯，GFAP是星形膠質細胞的特異性標志物，它的增多表明星形膠質細胞被活化，活化的星形膠質細胞可作為神經(jīng)損傷標志[12]。本實驗中AA組NADPH-d陽性神經(jīng)元增加，NADPH-d組織化學被用于標記NOS陽性神經(jīng)元，它與NOS陽性神經(jīng)元有廣泛的共定位[13]。在大鼠后肢急性疼痛模型中，后足注射福爾馬林，大鼠薄束核區(qū)NOS表達增加[14]。過多的NO會導致氧化應激，膠質細胞接觸過氧化物又會產(chǎn)生大量的NO，這樣形成惡性循環(huán)，加速組織損傷[15]。從GFAP和NOS表達情況可知AA組薄束核區(qū)存在嚴重炎性反應。本實驗中，2，5-HD組薄束核區(qū)出現(xiàn)明顯的異常NADPH-d陽性結構。Tan等[16]研究表明在老年大鼠腰骶脊髓灰質背角、背聯(lián)合核、后索會出現(xiàn)年齡相關性NADPHP-d陽性體，這些異常退變結構隨著年齡增加而增加，并認為其可作為神經(jīng)退行性變的標志；李銀花[17]報道在老年狗和猴的腰骶背側脊髓存在年齡相關性的NADPH-d陽性碩變神經(jīng)纖維，這些碩變纖維也是隨著年齡增大而增多增粗；賈云格[7]報道在老年鴿子和老年鼠的延髓有年齡相關性NADPH-d陽性小體，認為小體可能是神經(jīng)軸突崩解形成。2，5-HD作用于大鼠出現(xiàn)的薄束核的這一病理改變，與以往自然衰老情況下的NADPH-d形態(tài)相似，但陽性體密度較自然衰老的稍低。

以往研究表明2，5-HD引起神經(jīng)軸突運輸障礙[18]，使神經(jīng)軸突出現(xiàn)腫脹和功能紊亂，軸突代謝異常，進而引起軸突發(fā)生退行性變。推測2，5-HD 可能加速了神經(jīng)損傷，使神經(jīng)細胞代謝紊亂引起NOS 異常聚集，使薄束核區(qū)出現(xiàn)年齡相關性退行性變。CGRP 是一種神經(jīng)肽，主要分布于延髓、三叉神經(jīng)束等，研究表明在三叉神經(jīng)系統(tǒng)CGRP 與NO 相互作用可以調(diào)節(jié)痛敏[19]；動物實驗表明NO 供體可以促進三叉神經(jīng)釋放CGRP，并能增加三叉神經(jīng)脊束核NOS 陽性神經(jīng)元和CGRP 陽性神經(jīng)元[20]。本實驗化學毒素損傷引起的NOS 表達增多并未使薄束核區(qū)CGRP 表達出現(xiàn)明顯變化，這可能是與其局部神經(jīng)代謝有關。總之，AA 和2，5-HD 對薄束核的病理影響不同，AA 主要引起薄束核膠質細胞增生，有害性神經(jīng)遞質增多，產(chǎn)生炎癥反應而損傷神經(jīng)。2，5-HD 則可能使薄束核產(chǎn)生嚴重代謝障礙，從而引起神經(jīng)軸突和神經(jīng)元損傷，加速薄束核出現(xiàn)神經(jīng)退行性變。

這2 種毒素對薄束核產(chǎn)生的病理改變具體機制還有待進一步研究。