葉東雯

從目前臨床情況來(lái)看,有＞50%的人群存在幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的情況,但是實(shí)際上只有一部分患者會(huì)發(fā)生消化道疾病,因此臨床對(duì)于Hp 感染和消化道疾病之間的關(guān)系一直是臨床研究的焦點(diǎn)［1］。其中Hp 感染致病的差異性是研究的重點(diǎn),在很多研究中均可發(fā)現(xiàn),幾乎所有的Hp 菌株均存在尿素酶、粘附因子等多種毒力因素的影響,因此其并不能對(duì)Hp 感染出現(xiàn)不同臨床結(jié)果的現(xiàn)象做出合理解釋。近些年的研究中發(fā)現(xiàn),在Hp 致病性中有一個(gè)因素起到了重要作用,即Hp 毒素,在一些學(xué)者的研究中指出［2］,在具有空泡毒素活性的Hp 營(yíng)養(yǎng)液中可以查到一種相對(duì)分子量為128000 的蛋白質(zhì),雖然其并不直接介導(dǎo)毒素的活性,但是與空泡毒素的表達(dá)存在密切關(guān)系［3-6］,因此臨床將其稱為CagA,并且其只存在于具有空泡毒素活性的菌株中。因此,本研究選擇163例消化道疾病患者作為研究對(duì)象,觀察Hp 的CagA 基因與其之間的關(guān)系,為臨床的預(yù)防和診斷提供科學(xué)依據(jù),具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2017年4月～2018年12月就診于本院的163例消化道疾病患者作為本次研究對(duì)象,其中男81例,女82例；年齡23～65 歲,平均年齡(44.2±7.3)歲。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和鑒定 將選取的胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行無(wú)菌研磨處理,將其接種在Karmali 血平板上,在37℃、微需氧條件下培養(yǎng)5 d 后觀察結(jié)果。選出合格菌落對(duì)其實(shí)施革蘭染色鏡檢,并進(jìn)行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)以及尿素酶基因檢測(cè)。將使用上述方法進(jìn)行確定的Hp 菌株使用布氏肉湯加入小牛血清(10%)進(jìn)行增菌培養(yǎng),培養(yǎng)5 d 后將菌液加入20%的甘油,混和后將其迅速放置于-80℃環(huán)境中進(jìn)行凍存。

1.2.2 模板DNA 的制備 取少許Hp 菌落置于200 μl凍存液中制成Hp 混懸液,取1 μl Hp 混懸液加入裂解液200 μl(含有蛋白酶K,濃度200 mg/L),經(jīng)55℃水浴10 min,煮沸10 min 后,以1×104r/min 離心5 min,取上清液5 μl用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增CagA 基因PCR引物針對(duì)CagA基因保守區(qū)設(shè)計(jì),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：D008 5-ATAATGCTAAATTAGACAACTTCAGCGA-3(nt 1751-1778),R0085-TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT-3(nt 2021-2048),擴(kuò)增靶位片斷長(zhǎng)度為297 bp,PCR 反應(yīng)液體積20 μl,內(nèi)含有1 μmol D008/R008引物,2.0 U Taq DNA聚合梅,0.4 mmol dNTP,2.0 mmol MgCl2。反應(yīng)條件：94℃變性5 min,35 個(gè)循環(huán)(94℃變性5 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min),終止延伸72℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)18 g/L 瓊脂糖凝膠電泳,0.5 μg/L 溴化乙錠染色,于紫外光燈下顯影。以菌株NCTC11637CagA 陽(yáng)性作陽(yáng)性對(duì)照,去離子水作空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 163例消化道疾病患者的胃黏膜標(biāo)本中分離出Hp 菌株43 株,陽(yáng)性率為26.38%。其中消化性潰瘍18 株(包括十二指腸潰瘍和胃潰瘍),淺表性胃炎6 株,萎縮性胃炎4 株,胃癌15 株。

2.2 CagA 基因在消化道疾病中的分布 43 株Hp 菌株中,CagA 基因陽(yáng)性率為81.40%(35/43),CagA 基因在消化性潰瘍中的陽(yáng)性率為83.33%(15/18),在淺表性胃炎中的陽(yáng)性率為50.00%(3/6),在萎縮性胃炎中的陽(yáng)性率為75.00%(3/4),在胃癌中的陽(yáng)性率為93.33%(14/15)。胃癌的CagA 基因陽(yáng)性率高于淺表性胃炎,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.2191,P=0.0223＜0.05)；消化性潰瘍、萎縮性胃炎與淺表性胃炎的CagA 基因陽(yáng)性率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.6667、0.6250,P=0.1025、0.4292＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 CagA 基因與腸上皮化生以及慢性胃炎急性活動(dòng)程度之間的關(guān)系 163例消化道疾病患者中有慢性胃炎患者52例。Hp CagA 陽(yáng)性慢性胃炎患者的中、重度急性活動(dòng)性胃炎發(fā)生率為76.67%,高于CagA 陰性慢性胃炎患者的31.82%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Hp CagA 陽(yáng)性慢性胃炎患者的腸上皮化生發(fā)生率為53.33%,與CagA 陰性慢性胃炎患者的36.36%比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 CagA 基因在消化道疾病中的分布情況(株,%)

表2 CagA 基因與腸上皮化生以及慢性胃炎急性活動(dòng)程度之間的關(guān)系(n,%)

3 討論

在本次研究中可以發(fā)現(xiàn),163例消化道疾病患者的胃黏膜標(biāo)本中,分離出了Hp 菌株43 株,43 株Hp 菌株中,CagA 基因陽(yáng)性率為81.40%(35/43),此結(jié)果提示,在43例患者感染Hp 菌株中有81.40%含有CagA 基因,這與相關(guān)研究［7-9］結(jié)果一致。結(jié)果還顯示,CagA 基因在消化性潰瘍中的陽(yáng)性率為83.33%(15/18),在淺表性胃炎中的陽(yáng)性率為50.00%(3/6),在萎縮性胃炎中的陽(yáng)性率為75.00%(3/4),在胃癌中的陽(yáng)性率為93.33%(14/15)。胃癌的CagA 基因陽(yáng)性率高于淺表性胃炎,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.2191,P=0.0223＜0.05)；消化性潰瘍、萎縮性胃炎與淺表性胃炎的CagA 基因陽(yáng)性率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.6667、0.6250,P=0.1025、0.4292＞0.05)。此結(jié)果提示,CagA 陽(yáng)性基因與胃癌的發(fā)生有密切關(guān)系,當(dāng)CagA 基因陽(yáng)性率達(dá)到90%以上時(shí)需要警惕胃癌的發(fā)生,同時(shí)通過(guò)CagA 陽(yáng)性率還可以對(duì)消化性潰瘍、萎縮性胃炎以及淺表性胃炎進(jìn)行判斷,尤其是對(duì)于無(wú)明顯臨床癥狀的患者［10-14］。在本次研究中,作者選取了52例慢性胃炎進(jìn)行了研究,經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)CagA 陽(yáng)性Hp 感染者的炎性活動(dòng)程度與CagA 陰性Hp感染者相比明顯較高,這可能與具有CagA 陽(yáng)性Hp 菌株可產(chǎn)生空泡毒素誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8 和白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α,促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化等有關(guān)。在腸上皮化生發(fā)生率方面Hp CagA 陽(yáng)性感染患者與CagA 陰性感染患者之間的差異并不大,此結(jié)果提示,CagA 和腸上皮化生的發(fā)生關(guān)系不大。

綜上所述,Hp 的毒力因子CagA 與消化道疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系,以胃癌最為明顯,且在Hp CagA陽(yáng)性感染中發(fā)生中、重度急性活動(dòng)性胃炎的幾率較高,臨床可通過(guò)對(duì)CagA 基因陽(yáng)性率來(lái)判斷疾病發(fā)生的可能性,對(duì)相關(guān)疾病的發(fā)生采取積極預(yù)防措施。