李含雄 孫 將 袁月祥

（中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041）

目前，我國動物糞便年排泄量達(dá)38億噸[1]。大腸桿菌在畜禽糞便中普遍存在，在人畜共患病中是最常見的一種條件致病菌[2]，特別容易引起養(yǎng)殖動物發(fā)病[3]。殺滅包含大腸桿菌在內(nèi)的病菌蟲卵，在畜禽糞便無害化與資源化中具有重要意義。常用殺滅大腸桿菌的方法包括高溫堆肥[4]、滾筒干燥[5]、厭氧消化[6]等，因大多數(shù)種類的大腸桿菌不耐熱[7]，高溫堆肥是最常用的殺滅病菌蟲卵的方法，但其滅殺效果受曝氣量、物料C/N、堆體pH值、含水率等堆肥工藝影響。近10余年來，養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖方式和堆肥工藝發(fā)生了較大變化，但系統(tǒng)性研究高溫對畜禽糞便大腸桿菌滅殺作用的報道仍較少。本文系統(tǒng)性地研究了在不同溫度下不同處理時間對大腸桿菌的滅殺作用，并在強制好氧堆肥中進(jìn)行工程驗證，闡明高溫對大腸桿菌的滅殺規(guī)律，進(jìn)而指導(dǎo)養(yǎng)殖業(yè)糞便處理，達(dá)到糞便無害化標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基。

1.1.2 樣品采集

新鮮雞糞取自四川省井研縣王村鎮(zhèn)養(yǎng)雞場，雞糞堆肥樣品取自該養(yǎng)雞場的強制好氧堆肥槽中（該堆肥槽長80 m、寬12 m、高2 m）第1、2、3、5、8、12、16、20、24 d的堆體中，取樣時，在該天槽體斷面中左、中、右三個點處取樣，取樣深度距離堆肥表面1 m，取樣后冷藏保存。

新鮮豬糞取自樂山沙灣養(yǎng)豬場，豬糞堆肥取自該養(yǎng)豬場的強制好氧堆肥槽中（該堆肥槽長30 m、寬10 m、高2 m）。取樣時間點和取樣深度同雞糞堆肥樣品。

1.2 槽式堆肥溫度測定

在堆肥樣品取樣點利用長桿水銀溫度計測定堆體溫度，同一地點測定離表面30 cm（表層）和100 cm（中層）2個深度的溫度。

1.3 高溫處理對大腸桿菌的滅殺試驗設(shè)計

稱取適量新鮮糞便樣品充分混勻，然后采用四分法取樣裝入500 mL廣口瓶中，每瓶裝100 g樣品，分別放入不同培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫處理，溫度設(shè)置45℃（豬糞無此溫度）、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃等6個梯度。每隔12 h將廣口瓶中糞便混勻后取適量樣品進(jìn)行大腸桿菌計數(shù)。每個試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.4 大腸桿菌計數(shù)

均勻稱取10 g樣品，裝入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，搖床振動20 min，使得大腸桿菌均勻分布于無菌水中，將菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取適宜梯度按照“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)[9]”的平板計數(shù)法進(jìn)行大腸桿菌計數(shù)。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 高溫處理對雞糞中大腸桿菌的殺滅作用

不同溫度處理不同時間后，雞糞樣品中大腸桿菌的數(shù)量結(jié)果見表1。經(jīng)過不同的高溫處理，雞糞中的大腸桿菌數(shù)量均從2.0×107cfu/g下降到0 cfu/g；55℃及其以上溫度處理12 h后可全部殺滅雞糞中的大腸桿菌，45℃處理則需要72 h才能全部殺滅雞糞中的大腸桿菌。說明高溫處理可全部滅殺雞糞中的大腸桿菌，且溫度越高所需時間越短。

2.2 高溫處理對豬糞中大腸桿菌的殺滅作用

不同溫度處理不同時間后，豬糞樣品中大腸桿菌的數(shù)量結(jié)果見表2。從表2可知：經(jīng)過不同的高溫處理，豬糞中的大腸桿菌數(shù)量均從1.38×107cfu/g下降到0 cfu/g；55℃及其以上溫度處理12 h后可全部殺滅豬糞中的大腸桿菌，50℃處理則需要36 h才能全部殺滅豬糞中的大腸桿菌。55℃及其以上溫度對豬糞和雞糞樣品中大腸桿菌的滅殺效果一樣，均是12 h能全部滅殺。但在稍低溫度50℃時，對豬糞樣品中大腸桿菌的滅殺效果稍弱，處理12 h時，豬糞中殘留大腸桿菌比雞糞樣品多一個數(shù)量級，全部滅殺時間比雞糞樣品要長12 h。

2.3 雞糞好氧堆肥工程中大腸桿菌變化規(guī)律

在實驗室進(jìn)行高溫處理滅殺大腸桿菌試驗的基礎(chǔ)上，為了研究實際的高溫堆肥工程對大腸桿菌的殺滅作用，采集雞糞好氧槽式堆肥不同發(fā)酵天數(shù)的樣品來測定大腸桿菌數(shù)量，并現(xiàn)場測定該點溫度。其結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，該槽式堆肥溫度從第0 d的14.5℃逐步上升，第1 d達(dá)到38℃并維持2 d中溫發(fā)酵，第5 d達(dá)到65℃（中層）～69℃（表層），一直到第16 d均維持在63℃（中層）～58℃（表層）以上，16 d以后溫度才逐步下降；且從第5 d開始，堆肥表層溫度均明顯高于中部溫度。

表1 不同高溫處理后雞糞大腸桿菌數(shù)量變化 （cfu/g）

表2 不同高溫處理后豬糞大腸桿菌數(shù)量變化 （cfu/g）

該堆肥場在進(jìn)料時鋪一層雞糞后加一層輔料和適量的發(fā)酵菌種，然后用鏟車推高到2 m左右，1 d的原料全部進(jìn)完后再用翻堆機從尾端開始向后翻耙，使發(fā)酵料與新鮮原輔料混勻。本試驗中，由于開始物料未充分混勻，且前面3 d物料堆肥地面未鋪設(shè)曝氣管，氧氣供應(yīng)不足，故溫度第1 d升到38℃后一直維持到40℃附近；從第4 d開始曝氣后，堆體才進(jìn)入快速升溫階段，第5 d至第16 d均維持在高溫階段，此為快速發(fā)酵階段。16 d后，堆體溫度逐步下降到40℃附近，說明堆肥物料中的易利用物質(zhì)大量消耗，發(fā)酵產(chǎn)生的熱能不足以維持翻堆、水汽帶走的熱量。從第5 d開始，表層溫度高于中部溫度，估計是堆肥底部曝氣不足，導(dǎo)致中部沒有足夠的氧氣供發(fā)酵菌種利用，而表層疏松度較好，能從空氣中補充氧氣，從而滿足發(fā)酵菌種的氧氣需求。因此試驗采樣深度為1.0 m更具代表性。

在此過程中，堆肥中大腸桿菌數(shù)量呈指數(shù)下降，從第0 d的5.5×107cfu/g快速下降到第3 d的13.7 cfu/g，從第5 d開始堆肥中大腸桿菌的數(shù)量一直保持為0。本工程前3 d大腸桿菌的數(shù)量快速下降6個數(shù)量級，與實驗室45℃連續(xù)處理72 h可全部滅殺大腸桿菌結(jié)果相近。加上隨后連續(xù)10余天的高溫階段堆體中均沒有大腸桿菌，說明正常運行的強制曝氣槽式堆肥足以殺滅雞糞中的病菌蟲卵，滿足國標(biāo)的衛(wèi)生要求[8]。

2.4 豬糞好氧堆肥工程中大腸桿菌變化規(guī)律

豬糞好氧堆肥工程中不同發(fā)酵天數(shù)堆體中大腸桿菌數(shù)量和堆體溫度如圖2所示。由圖2可知，前2 d堆體溫度從室溫逐步上升到40℃，然后又下降到30℃；前5d中層平均溫度為35.4℃，表層平均溫度為29.9℃；直到第8 d才達(dá)到高溫階段，隨后溫度有所回落，并一直維持在中（中層）高（表層）溫附近。咨詢該堆肥場，得知采樣前幾天，堆體運行不太正常，影響了前5 d的升溫。加上鼓風(fēng)機設(shè)備異常，堆體中后段曝氣不足，導(dǎo)致中部溫度明顯偏低。工程發(fā)酵異常，導(dǎo)致前期堆體中大腸桿菌數(shù)量明顯偏高。大腸桿菌數(shù)量從第0 d的6.2×107cfu/g下降到了第2 d的2.55×104cfu/g，隨后到第5 d仍有達(dá)到3.85×102cfu/g，第8 d進(jìn)一步下降到10 cfu/g，第12 d起均下降到0 cfu/g。結(jié)合實驗室高溫殺滅大腸桿菌試驗和雞糞堆肥工程數(shù)據(jù)可知，當(dāng)堆肥溫度低于40℃時，對大腸桿菌的殺滅作用就很弱。

對比2個好氧槽式堆肥工程，均有一樣的翻堆設(shè)備，但曝氣機運行工況有差異，從而導(dǎo)致2個工程中的堆體溫度和大腸桿菌含量均有非常顯著的差異。說明在槽式堆肥中，最重要的關(guān)鍵條件是氧氣的有效通入，翻堆只能短暫地促進(jìn)空氣交換，翻堆更重要的目的是使物料更均一，曝氣才能實現(xiàn)更長、更持續(xù)的氧氣通入，曝氣量對畜禽糞便的無害化有著很大的影響。相比20年前Hima-thongkham等[10]以牛糞高溫堆肥大腸桿菌與沙門氏菌第10 d依然還有10%，強制曝氣好氧堆肥技術(shù)更易實現(xiàn)畜禽糞便的無害化。

3 結(jié)論

本次試驗研究了不同溫度滅殺新鮮畜禽糞便中大腸桿菌的效果，并對大規(guī)模的堆肥工程中的大腸桿菌與發(fā)酵溫度的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在45℃下持續(xù)處理72 h可有效滅殺畜禽糞便中的大腸桿菌，在堆肥工程中，由于物料均勻度和發(fā)酵溫度的差異，全部滅殺畜禽糞便大腸桿菌的時間延長到5 d。當(dāng)發(fā)酵溫度低于40℃時，對大腸桿菌的殺滅作用很弱。因此需保證堆體中各點的溫度均應(yīng)至少達(dá)到40℃以上。強制曝氣堆肥工程中，曝氣量是比翻堆更重要的關(guān)鍵因素，也是滅殺大腸桿菌等病菌蟲卵的關(guān)鍵參數(shù)。一個正常運行的好氧堆肥工程能夠全部滅殺大腸桿菌。