李 亮 樊福好

（廣東省畜牧技術(shù)推廣總站，廣東廣州 528300）

飼料中的蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)的重要指標(biāo)，測(cè)定蛋白質(zhì)的方法有凱氏定氮法（國(guó)際經(jīng)典測(cè)定方法）、分光光度法、滴定法等。飼料行業(yè)中測(cè)定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法，它是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被普遍作為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法。但凱氏定氮法無法區(qū)分“真蛋白”與其他含氮有機(jī)物，在生物蛋白的檢測(cè)中有一定的局限性，因此，F(xiàn)olin—酚試劑法、Lowry法、考馬斯亮藍(lán)法等許多其他的蛋白檢測(cè)方法也得到了大量研究和發(fā)展[1]。

飼料中的有機(jī)氮并不能完全被動(dòng)物利用，僅測(cè)定總有機(jī)氮無法完全反映飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以測(cè)定水溶性蛋白的檢測(cè)方法得到了發(fā)展和應(yīng)用[2]。考馬斯亮藍(lán)法是目前實(shí)驗(yàn)室中最常見、靈敏度最高的一種測(cè)定水溶性蛋白質(zhì)含量的方法[3]。它將比色法和染料結(jié)合法相結(jié)合，與Lowry法等其他方法相比，具有所需樣品量少、測(cè)定速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[4]，適合于大批量、低可溶蛋白樣品的測(cè)定[5]，被廣泛應(yīng)用于各類生物樣品的水溶性蛋白含量測(cè)定[6]。該方法還具有干擾物質(zhì)少的特點(diǎn)，是生物化學(xué)、植物生理學(xué)等實(shí)驗(yàn)課程中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。

水溶性蛋白也是評(píng)價(jià)動(dòng)物飼料蛋白營(yíng)養(yǎng)的重要指標(biāo)之一，尤其是大豆中只有可溶蛋白才能被利用[7]，但一般植物體內(nèi)水溶性蛋白含量較低[8]，目前對(duì)飼料中水溶性蛋白的研究較少[9]，也沒有與生長(zhǎng)性能關(guān)系研究的報(bào)道，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在探索豬的健康快速評(píng)價(jià)方法時(shí)，可應(yīng)用顯色法對(duì)飼料蛋白營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行快速判定[10]。為簡(jiǎn)化試驗(yàn)方法并推廣其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，樊福好參考比色法定義了一個(gè)命名為“朊度”的無量綱，即利用微型電子裝置發(fā)明了便攜型檢測(cè)設(shè)備，可發(fā)出特定波長(zhǎng)的光線，并利用電子感應(yīng)裝置測(cè)量溶液透光特性，根據(jù)透光特性的變化，在顯示屏上顯示0～100的數(shù)值，規(guī)定為“朊度”值。為了評(píng)估快速檢測(cè)技術(shù)在生產(chǎn)一線的應(yīng)用價(jià)值，本研究將“朊度”值與721G分光光度計(jì)測(cè)量值進(jìn)行了比較和相關(guān)性分析，并對(duì)小豬飼料的基本營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和“朊度”值進(jìn)行了測(cè)量，與部分生長(zhǎng)性能指標(biāo)進(jìn)行了聯(lián)合分析，希望為動(dòng)物飼料的快速、簡(jiǎn)易評(píng)價(jià)方法的開發(fā)提供參考，增加終端用戶對(duì)動(dòng)物飼料的快速評(píng)估手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

配制1 mg/mL牛血清蛋白（BSA,Bovine Serum Albumin）溶液，并按 0.125 mg/mL的梯度稀釋至0.125 mg/mL；顯色試劑和便攜型光學(xué)檢測(cè)設(shè)備由廣州九卦生物科技有限公司提供；721G可見分光光度計(jì)由上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；購買4種市售小豬飼料：甲公司中、低檔料分別編號(hào)為1、2號(hào)，乙公司中檔料編號(hào)為3號(hào)，丙公司中檔料編號(hào)為4號(hào)；隨機(jī)采樣檢測(cè)其營(yíng)養(yǎng)成分（見表1）。動(dòng)物試驗(yàn)選用50～70日齡三元雜閹公豬66頭，隨機(jī)分成A、B、C、D 4個(gè)組，其中A組16頭，B組16頭，C組17頭，D組17頭。

表1 各飼料主要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析

1.2 試驗(yàn)方法

取不同濃度的BSA溶液1份加入9份顯色試劑中進(jìn)行顯色反應(yīng)，10 min后分別使用721G分光光度計(jì)和便攜型光學(xué)檢測(cè)設(shè)備測(cè)量溶液的吸光度和“朊度”值，并分析其相關(guān)性和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差。取5 g飼料置燒杯中，加45 mL水浸泡20 min后用玻璃棒攪拌，之后靜置3 min，取上清液1份加入9份顯色試劑，反應(yīng)10 min，使用便攜型光學(xué)檢測(cè)設(shè)備測(cè)量其“朊度”值。動(dòng)物試驗(yàn)在廣東某規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行，各組飼養(yǎng)條件一致，密度適中，自由采食飲水，常規(guī)飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)開始與結(jié)束時(shí)早晨空腹稱重。記錄試驗(yàn)期間豬的采食量，計(jì)算平均采食量、平均增重、平均末重、料肉比等。

1.3 分析方法

根據(jù)測(cè)量值計(jì)算平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，Relative Standard Deviation）并進(jìn)行比較；選擇SPSS數(shù)據(jù)分析軟件的單因素ANOVA或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并進(jìn)行S-N-K或Tamhane's T2事后多重比較，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸光值測(cè)量結(jié)果與分析

測(cè)量不同濃度BSA溶液吸光值，同步測(cè)量“朊度”值，并進(jìn)行相關(guān)度分析。不同濃度BSA溶液在592 nm的吸光度與對(duì)應(yīng)“朊度”值見表2。分析“朊度”測(cè)量值與不同濃度BSA在592 nm的吸光度相關(guān)性見表3。通過對(duì)每次測(cè)量重復(fù)10次，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差（STDEV,StandardDeviation）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可得表4。

表2 不同濃度BSA溶液在592 nm吸光度和 “朊度”測(cè)量平均值

表3 “朊度”與BSA溶液在592 nm吸光度的相關(guān)系數(shù)

表4 不同濃度BSA溶液10次 “朊度”測(cè)量值重復(fù)性特征

利用表2的數(shù)據(jù)，以O(shè)D592為X值，對(duì)“朊度”（Y） 求回歸方程，可得 Y＝80.919X－18.225，2＝0.988，可知回歸直線對(duì)觀測(cè)值的擬合程度較好；通過分析二者的相關(guān)性（見表3），可知“朊度”測(cè)量值與BSA溶液在592 nm處的吸光度有極顯著正相關(guān)（＜0.01）；通過計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可知（見表4），其RSD均小于5%，可以認(rèn)為儀器測(cè)量結(jié)果比較穩(wěn)定可靠。

在實(shí)際生產(chǎn)中，飼料企業(yè)要測(cè)量自有產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，一般采用凱氏定氮法，需要花費(fèi)大量的人力物力和時(shí)間；即便近年許多飼料企業(yè)采取了近紅外光譜法（NIR,Near Infrared）快速測(cè)量飼料營(yíng)養(yǎng)，但由于各地原料、配比各不相同，各企業(yè)也要在建立模型、數(shù)據(jù)庫的修正和維護(hù)上花費(fèi)大量的人力物力，上述因素都導(dǎo)致了飼料檢測(cè)成本較高。此外，工廠的測(cè)量數(shù)據(jù)一般是企業(yè)的商業(yè)秘密，所取得的數(shù)據(jù)一般也只是用于生產(chǎn)質(zhì)控，而不適宜用于營(yíng)銷，更遑論向客戶公開。

因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)一線的決策者對(duì)飼料蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的了解和判斷，都僅限于飼料標(biāo)簽上模糊的范圍和業(yè)務(wù)員口頭的承諾，最多也只是采一點(diǎn)樣送到機(jī)構(gòu)檢測(cè)化學(xué)成分。對(duì)于送檢也存在以下3方面問題：①時(shí)間差，外檢最快也要1個(gè)星期出結(jié)果，影響決策的及時(shí)性；②對(duì)于飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的實(shí)際生物利用價(jià)值沒有有效判斷，如三聚氰胺就是典型的例子；③送檢的樣品往往還有采樣規(guī)范性、采樣數(shù)量、檢測(cè)成本等多方面的限制，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有限，不僅指導(dǎo)生產(chǎn)的作用有限，而且連打官司都不好作為有力證據(jù)。因此，對(duì)于生產(chǎn)一線的決策者和飼料業(yè)務(wù)員而言，更需要一種快速、可靠的判斷飼料相對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的工具，而“朊度”檢測(cè)在一定程度上，可以承擔(dān)這樣的任務(wù)。

“朊度”檢測(cè)只需要一點(diǎn)飼料，即可用近乎“零”的成本，在短短20 min內(nèi)得出一個(gè)相對(duì)可靠的結(jié)論。與傳統(tǒng)的在杯子里泡一點(diǎn)飼料，然后觀看飼料成分上浮、下沉不同的是：“朊度”測(cè)試可以給出一個(gè)具體的數(shù)字，而且這個(gè)數(shù)字不僅穩(wěn)定可靠（RSD＜5%，見表4），還與規(guī)范操作的蛋白成分檢測(cè)數(shù)據(jù)呈極顯著正相關(guān)（＜0.01，見表3）。理論上，在生產(chǎn)一線可以利用“朊度”試劑與便攜式儀器，對(duì)飼料蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值快速作出大量可靠的相對(duì)性測(cè)量，從而為生產(chǎn)決策提供快速可靠的依據(jù)。

2.2 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析

小豬按組飼喂不同小豬料，A、B、C、D組分別飼喂1、2、3、4號(hào)料，飼養(yǎng)時(shí)間103 d，結(jié)果如表5。計(jì)算飼料的“朊度”測(cè)量值與生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性可得表6。

但值得注意的是：因商品飼料的原料來源廣泛、配比十分復(fù)雜，在某個(gè)試驗(yàn)得出的對(duì)比結(jié)論，可能僅僅只能說明特定時(shí)空某幾種指定產(chǎn)品的性能差異，并不一定能代表普遍規(guī)律。本試驗(yàn)中，因?yàn)椤半枚取睖y(cè)量值剛好與飼料粗蛋白含量呈現(xiàn)正相關(guān)規(guī)律，而且受種種因素影響，用于對(duì)比的商品飼料所用原料可能比較接近，因此，有時(shí)“朊度”值與小豬生長(zhǎng)成績(jī)的相關(guān)規(guī)律也可以解釋為粗蛋白含量不同所形成的影響。但不可否認(rèn)的是，終端用戶在短時(shí)間內(nèi)不可能知道商品飼料的實(shí)際粗蛋白值含量，在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的“朊度”值測(cè)量，可以顯著提高用戶對(duì)飼料質(zhì)量的快速判斷能力。

表5 試驗(yàn)小豬生長(zhǎng)數(shù)據(jù)及飼料 “朊度”測(cè)量值均值

表6 “朊度”測(cè)量值與生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性

此外，由于凱氏定氮法檢測(cè)的是樣品中所有有機(jī)氮，如果飼料中含有較多角蛋白或其他難溶有機(jī)含氮物質(zhì)時(shí)，其“朊度”測(cè)量值會(huì)相對(duì)較低，這也可以在一定程度上反映不同商品飼料中粗蛋白的易消化性差異。

3 結(jié)論

參照比色法發(fā)明的便攜式檢測(cè)設(shè)備所測(cè)量的“朊度”值，與721G分光光度計(jì)測(cè)量值具有極顯著線性相關(guān)，回歸曲線的擬合度較高。分析顯示其能夠快速且穩(wěn)定測(cè)量一定濃度的飼料可溶性蛋白含量。原料接近的商品飼料飼喂試驗(yàn)證明，使用“朊度”值較高的飼料喂養(yǎng)的小豬生長(zhǎng)成績(jī)更好，可以取得更高的經(jīng)濟(jì)收益。