王美皓，王家敏，劉文凱，佛生福，靳冬武，馬玉梅，馬忠仁，喬自林，丁功濤

(1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；4.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010；5.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

犬腎細(xì)胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells,MDCK細(xì)胞)是由Madin和Darby于1958年從一只母曲架犬腎臟組織分離培養(yǎng)建立[1].由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，是公認(rèn)的適于流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系[2-5].血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).在動(dòng)物血清中牛血清又是最常用、最合適、最有效的培養(yǎng)基成分.在培養(yǎng)基中加入適量的牛血清，不僅可以有效促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，還能夠縮短細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，從而加快疫苗的生產(chǎn)，提高疫苗的產(chǎn)量，為疫苗生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)更多的利益[6].目前市場(chǎng)上血清種類繁多，質(zhì)量參差不齊，因此開(kāi)發(fā)相關(guān)血清替代物代替血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗產(chǎn)品具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[7].本試驗(yàn)以進(jìn)口胎牛血清為對(duì)照，探究3個(gè)儲(chǔ)存溫區(qū)37 ℃、4 ℃、-20 ℃下血清替代物(Billion cell)支持MDCK細(xì)胞體外培養(yǎng)的特性與效果，評(píng)估Billion cell培養(yǎng)效果.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 貼壁培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞從ATCC引進(jìn)，引進(jìn)后由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心按《中國(guó)藥典》2010版的要求建立主細(xì)胞庫(kù)(MDCK-M-60，P60)和工作細(xì)胞庫(kù)(MDCK-W-63，P63).

1.1.2 培養(yǎng)基 DEME(high-glucous)購(gòu)自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20190318.

1.1.3 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購(gòu)自Hyclone(SV30087.02，NVM0344)，使用時(shí)按10%(V/V)添加到培養(yǎng)基中.

血清替代物(Billion cell)：由蘭州百靈生物技術(shù)有限公司開(kāi)發(fā)配制，使用時(shí)按10%(V/V)添加到培養(yǎng)基中.使用前儲(chǔ)存至三個(gè)溫區(qū)分別為37 ℃、4 ℃、-20 ℃，驗(yàn)證其儲(chǔ)存條件.

1.1.4 主要試劑及儀器 0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)、0.2%臺(tái)盼藍(lán)(Sigma)、結(jié)晶紫染液(Sigma)、T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)、60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)、生物微倒置顯微鏡(Olympus，CKX-41)、CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher，3111型)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar，IC1000)等.

1.2 方法

1.2.1 靜置培養(yǎng)MDCK細(xì)胞傳代穩(wěn)定性觀察

用含有10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)蘇MDCK工作庫(kù)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至致密單層時(shí)，分別用含有10%的37 ℃、4 ℃、-20 ℃三個(gè)儲(chǔ)存溫區(qū)Billion cell及10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)傳代6代，每代細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)，按照1∶4比例傳代，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每代細(xì)胞在24 h、48 h、72 h拍照觀察細(xì)胞形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)、致密程度.

1.2.2 靜置培養(yǎng)MDCK細(xì)胞克隆形成率分析

克隆形成率是指貼壁細(xì)胞在低細(xì)胞密度下的集落形成，也就是克隆效率，是判斷細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)之一.取第6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，消化，制成細(xì)胞懸液，按照100個(gè)細(xì)胞/皿的細(xì)胞量接種細(xì)胞培養(yǎng)皿，并做平行3皿.將細(xì)胞培養(yǎng)皿置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，出現(xiàn)集落后，用吸管吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗，無(wú)水甲醇固定，結(jié)晶紫染色.觀察并對(duì)細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值.

克隆形成率(%)=(所形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%.

1.2.3 MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

取第6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，分別用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按有限稀釋法將混合均勻的MDCK貼壁細(xì)胞懸液稀釋至1×104/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接1 mL細(xì)胞懸液.將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h消化3孔計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,并比較培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的平均最大増殖密度、平均倍增時(shí)間[8]、平均比生長(zhǎng)速率[9].

倍增時(shí)間=T/A，A=log2(Y/X)

X為初始接種細(xì)胞數(shù)，Y為細(xì)胞最大増殖密度前一天的細(xì)胞數(shù)，T為培養(yǎng)時(shí)間.

比生長(zhǎng)速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X為活細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)時(shí)間，n和n-1為2個(gè)取樣計(jì)數(shù)時(shí)間點(diǎn).

使用Graphpad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 靜置培養(yǎng)MDCK細(xì)胞傳代穩(wěn)定性觀察

分別用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇MDCK工作庫(kù)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)良好(見(jiàn)圖1)，傳代2代后轉(zhuǎn)為分別含10% Billion cell(3個(gè)儲(chǔ)存溫區(qū)37℃、4℃、-20℃)和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)6代，-20℃儲(chǔ)存溫區(qū)的Billion cell和FBS均能較好促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，細(xì)胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列.4℃儲(chǔ)存溫區(qū)的Billion cell次之，37℃儲(chǔ)存溫區(qū)的Billion cell最差.4組血清及血清替代物分別培養(yǎng)MDCK細(xì)胞至第3代、第6代效果見(jiàn)表1.

圖1 MDCK細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)(A:48h,40×；B:72h,40×)

表1 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞效果比較(100×)

2.2 靜置培養(yǎng)MDCK細(xì)胞克隆率分析

4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞均形成了有效的集落數(shù)，平均集落形成率從高到低依次為-20℃ Billion cell、FBS、4℃ Billion cell、37℃ Billion cell組，分別為54.0±4.0%、46.5±5.5%、41.0±2.0%、32.0±3.0%.集落的形成效果見(jiàn)圖2，克隆形成率比較分析結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖2 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞形成集落

圖3 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞克隆率

2.3 MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析如圖4，平均比生長(zhǎng)速率分析見(jiàn)圖5，平均最大增殖密度和平均倍增時(shí)間比較分析見(jiàn)圖6、圖7.4組血清及血清替代物均能實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，但FBS和-20 ℃、4 ℃儲(chǔ)存溫區(qū)的Billion cell能較好促進(jìn)MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，平均集落形成率從高到低依次為-20 ℃ Billion cell、FBS、4 ℃ Billion cell、37 ℃ Billion cell；生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)平均比生長(zhǎng)速率、平均倍增時(shí)間和最大增殖濃度從高到低依次均為-20 ℃ Billion cell、FBS、4 ℃ Billion cell、37 ℃ Billion cell.

圖4 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖5 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率

圖6 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞平均倍增時(shí)間

圖7 4組血清及血清替代物培養(yǎng)MDCK細(xì)胞平均最大增殖密度

3 討論與結(jié)論

MDCK細(xì)胞目前廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，如狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、禽流感病毒等[1-2].目前，國(guó)內(nèi)外已批準(zhǔn)利用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗有人用狂犬疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等[3].我國(guó)目前還沒(méi)有自主研發(fā)的細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗上市，但已經(jīng)有多家企業(yè)正在利用MDCK細(xì)胞進(jìn)行流感疫苗的研發(fā)[10-12].

在培養(yǎng)貼壁型MDCK細(xì)胞時(shí)，血清是最常用、最合適、最有效的培養(yǎng)基成分.血清選擇不當(dāng)，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)不穩(wěn)定，而且血清價(jià)格昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)成本特別高.血清的選擇直接關(guān)系到研發(fā)進(jìn)度和疫苗企業(yè)的生產(chǎn)效益.本研究針對(duì)以上問(wèn)題，以進(jìn)口胎牛血清為對(duì)照，探究3個(gè)儲(chǔ)存溫區(qū)37 ℃、4 ℃、-20 ℃下血清替代物(Billion cell)支持MDCK細(xì)胞體外培養(yǎng)的特性與效果，評(píng)估Billion cell培養(yǎng)效果.結(jié)果顯示，MDCK細(xì)胞在-20 ℃、4 ℃儲(chǔ)存溫區(qū)的Billion cell中能較好的增殖培養(yǎng)，-20 ℃儲(chǔ)存溫區(qū)的Billion cell培養(yǎng)效果優(yōu)于FBS，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)較穩(wěn)定.Billion cell血清替代物在-20 ℃儲(chǔ)存條件下可以代替FBS用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng).