梁 歡 付 楝

[恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院中醫(yī)部(恩施州民族醫(yī)院)婦科，湖北省恩施市 445000，電子郵箱：lianghuan9731@163.com]

卵巢早衰是指卵巢功能衰竭所導(dǎo)致的40歲之前即閉經(jīng)的現(xiàn)象，特點是40歲以下女性的卵巢功能停止，閉經(jīng)，低雌激素和促性腺激素水平升高，伴有不同程度的低雌激素癥狀，如潮熱多汗、面部潮紅、性欲低下等[1-3]。卵巢早衰的災(zāi)難性后果是生育能力下降，這是由于大多數(shù)情況下沒有卵泡，而在其他情況下剩余卵泡無法對激素刺激做出反應(yīng)[4-5]。目前，調(diào)節(jié)原始卵泡激活、卵泡生長、卵泡存活或閉鎖過程所涉及的因素和機制尚未明確。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的機制靶標(biāo)是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其形成兩種不同的功能性復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶信號傳導(dǎo)在卵泡發(fā)生過程中具有重要意義，包括卵泡激活、發(fā)育和存活；作為磷脂酰肌醇3-激酶的下游靶標(biāo)，mTORC1參與卵泡發(fā)生的調(diào)節(jié)[8]。mTORC2的必需核心包含mTOR、哺乳動物應(yīng)激激活蛋白激酶相互作用蛋白、哺乳動物致死性SEC13蛋白8和雷帕霉素不敏感亞基Rictor。抑制mTORC2可導(dǎo)致整個原始卵泡池功能的抑制，可引起卵巢早衰和不孕[9]。但Rictor/mTORC2在卵泡發(fā)生中的作用目前尚不清楚。

石窯當(dāng)歸具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效，用于治療血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、虛寒腹痛、腸燥便秘、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍[10]。本研究擬探討石窯當(dāng)歸提取物對卵巢早衰大鼠的防治作用及Rictor/mTORC2信號通路的影響，為卵巢早衰的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器 石窯當(dāng)歸提取物(純度99.99%；湖北中醫(yī)藥大學(xué)提供，批號：SK-0609)；己烯雌酚(原料藥，純度99.99%；湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司，批號：190413)；環(huán)磷酰胺(美國Sigma公司，批號：M6025)；雌二醇、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)試劑盒(美國貝克曼庫爾特公司，批號：AW1258、XS6598、MN5287)；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：14896、K1622)；PrimeScript RT-PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司，批號：R0933)；放射免疫沉淀測定裂解緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水、增強的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：SC1063-5、C5039、SF1452-3)；二喹啉甲酸蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(中科瑞泰北京生物科技有限公司，批號：RTP7102)；兔抗人Rictor、mTORC2多克隆抗體(德國Sigma-Aldrich公司，批號：SAB1409702、SAB2456987)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體、多克隆山羊抗小鼠辣根過氧化物酶二抗(英國Abcam公司，批號：ab8245、ab7023)。貝克曼AU-480全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；CX31光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LightCycler 480實時熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士羅氏公司)。

1.2 實驗動物及分組 清潔級Wistar雌性大鼠100只，16周齡，體重250～300 g，貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黔)2019-0001；動物使用許可證號：SYXK(黔)2019-0012；動物質(zhì)量合格證號：00019041308]。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、模型組、己烯雌酚組、石窯當(dāng)歸提取物低劑量組(低劑量組)、石窯當(dāng)歸提取物高劑量組(高劑量組)，每組20只。動物自由攝取飼料、自由飲水，自動控制晝夜循環(huán)(12/12 h)，室溫(22±1)℃。

1.3 動物造模及給藥 取模型組、己烯雌酚組、低劑量組、高劑量組大鼠，腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg/kg，1次/d，連續(xù)5 d。注射第5天后對大鼠行陰道細(xì)胞涂片1次，觀察分析大鼠動情周期的變化，出現(xiàn)動情周期紊亂表示模型建立成功[11]。建模成功后，己烯雌酚組給予灌胃10.0 mg/kg的己烯雌酚(將己烯雌酚和生理鹽水配置成濃度為1.0 mg/mL的溶液，灌胃體積為10 mL/kg)；低劑量組、高劑量組給予灌胃20.0 mg/kg、40.0 mg/kg的石窯當(dāng)歸提取物(將石窯當(dāng)歸提取物和生理鹽水配置成濃度為2.0 mg/mL、4.0 mg/mL的溶液，灌胃體積為10 mL/kg)；對照組、模型組灌胃等體積(10 mL/kg)生理鹽水。均1次/d，持續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束后，股動脈取血3 mL,4℃ 5 000 r/min離心5 min獲取血清進行相關(guān)指標(biāo)的檢測；隨后頸椎脫臼處死大鼠，獲取卵巢組織用于后續(xù)研究。

1.4 血清FSH、LH、雌二醇水平測定 使用AU-480全自動生化分析儀及相應(yīng)試劑測定血清雌二醇、FSH、LH水平，按照說明書步驟進行操作。

1.5 卵巢病理結(jié)構(gòu)觀察 取大鼠卵巢組織，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋后，制成4 μm厚的石蠟切片，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察卵巢組織病理結(jié)構(gòu)變化。

1.6 卵巢組織Rictor和mTORC2 mRNA表達水平測定 將卵巢組織(100 mg)在液氮中研磨成粉末，并與1 mL TRIzol試劑混合后使用苯酚氯仿法提取總RNA。使用紫外分光光度法檢測RNAA260/A280比值后獲取RNA的純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在37℃下將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并在-20℃下儲存。使用PrimeScript RT-PCR試劑盒，使用U6作為內(nèi)參照，進行RT-PCR，測定Rictor、mTORC2 mRNA的相對表達水平。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司合成。Rictor正向引物為5′-AGCTGGUGTTGTGAATCAGGCCG-3′，反向引物為5′-GGTACTGUGTTGTGAACCTGATC-3′；mTORC2正向引物為5′-AACTGATGTGAATCCTGA-3′，反向引物為5′-TTGAGCGUGAAGTACCCTGA-3′；U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-CCGTGATCAGTTGCCA-3′。反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL qPCR混合物、1 μL引物、1 μL cDNA和8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：在95℃初始變性10 min，然后95℃ min，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算Rictor、mTORC2 mRNA相對表達水平。每個樣品按一式三份進行測試。

1.7 卵巢組織Rictor、mTORC2蛋白表達水平測定 將卵巢組織在液氮中研磨成粉末，并將100 mg粉末與含有1%苯甲基磺酰氟的100 μL預(yù)冷放射免疫沉淀測定裂解緩沖液混合，在4℃下裂解過夜。然后將混合物在4℃下1 000 r/min離心15 min。用二喹啉甲酸蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。然后將蛋白質(zhì)樣品(50 μg)與十二烷基硫酸鈉混合，加緩沖液后在沸水浴中變性10 min。將樣品在100 mV電壓下行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。成功分離蛋白質(zhì)后在冰上轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h。然后用兔抗人Rictor(1 ∶1 000稀釋)、mTORC2(1 ∶1 000稀釋)和GAPDH(1 ∶5 000稀釋)多克隆一抗在4℃孵育過夜。用含有吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌膜5次，5 min/次，將膜與多克隆山羊抗小鼠辣根過氧化物酶二抗(1 ∶10 000稀釋)在室溫下孵育1 h。用含有吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌膜5次，5 min/次。然后使用增強的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯影，于Image Lab v3.0成像軟件獲取和分析成像信號。根據(jù)GAPDH條帶灰度值計算Rictor、mTORC2蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清雌二醇、FSH、LH水平比較 與對照組比較，其余4組大鼠雌二醇水平降低，F(xiàn)SH、LH水平升高(P<0.05)；模型組、低劑量組、高劑量組、己烯雌酚組雌二醇水平依次升高，F(xiàn)SH、LH水平依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清雌二醇、FSH、LH水平比較(x±s)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與己烯雌酚組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05。

2.2 各組大鼠卵巢病理結(jié)構(gòu)變化 對照組卵巢結(jié)構(gòu)正常，可見原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡，黃體較多，分布均勻；模型組卵泡排列松散紊亂，早期、次級、成熟卵泡明顯減少；己烯雌酚組、石窯當(dāng)歸提取物低及高劑量組成熟卵泡增加，可見原始卵泡和大量初級卵泡、次級卵泡，黃體較多。見圖1。

圖1 5組大鼠卵巢病理結(jié)構(gòu)變化(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠卵巢組織Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白水平比較 與對照組比較，其余4組大鼠卵巢組織Rictor和mTORC2 mRNA、蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)；模型組、低劑量組、高劑量組、己烯雌酚組卵巢組織Rictor和mTORC2 mRNA、蛋白相對水平依次升高(均P<0.05)。見表2及圖2。

表2 5組大鼠卵巢組織Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白相對表達水平比較(x±s)

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與己烯雌酚組比較，cP<0.05；與低劑量組比較，dP<0.05。

圖2 5組大鼠卵巢組織Rictor、mTORC2蛋白表達水平

3 討 論

女性的生殖壽命最終取決于卵巢原始卵泡池的大小，卵巢原始卵泡池的大小通常在胚胎發(fā)育期間或出生后確定。為了產(chǎn)生用于受精的成熟卵母細(xì)胞，通過由卵泡激活的過程將原始卵泡從休眠卵泡的儲庫募集到生長的卵泡池中，隨后進行一系列的發(fā)育步驟[12]。在整個過程中，如果沒有選擇進一步生長，大量卵泡會發(fā)生凋亡性死亡(閉鎖)。當(dāng)原始卵泡池耗盡時，會發(fā)生更年期或卵巢早衰。

石窯當(dāng)歸為我國傳統(tǒng)中草藥，具有補血、活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸的功效，其主血虛諸證、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)、癥瘕結(jié)聚、崩漏、虛寒腹痛、痿痹、肌膚麻木、腸燥便難、赤痢后重、癰疽瘡瘍、跌撲損傷[13-14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠雌二醇水平降低，F(xiàn)SH、LH水平升高；模型組、低劑量組、高劑量組、己烯雌酚組雌二醇水平依次升高，F(xiàn)SH、LH水平依次降低(P<0.05)。這說明石窯當(dāng)歸提取物能改善卵巢早衰大鼠紊亂的性激素水平，且高劑量的作用效果更為明顯。己烯雌酚為非甾體雌激素，具有雌激素作用。己烯雌酚可改善如潮熱、煩躁失眠、陰道干燥等卵巢早衰癥狀，高劑量組FSH、LH水平略高于己烯雌酚組，這提示石窯當(dāng)歸提取物高劑量可獲得與己烯雌酚更為相似的卵巢早衰改善作用。此外，病理學(xué)結(jié)果顯示，模型組卵泡排列松散紊亂，早期、次級、成熟卵泡明顯減少；而己烯雌酚組、石窯當(dāng)歸提取物低、高劑量組成熟卵泡增加，可見原始卵泡和大量初級卵泡、次級卵泡，黃體較多。這提示石窯當(dāng)歸提取物能促進卵巢早衰大鼠卵泡發(fā)育、成熟。

靜息原始卵泡受局部細(xì)胞因子抑制以保持休眠。磷酸酶和張力蛋白同系物、卵母細(xì)胞中的結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1和結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2是維持原始卵泡靜止的抑制機制的一部分[15]。mTORC1在卵母細(xì)胞中不斷被抑制，并且可因mTORC1活性的選擇性升高而導(dǎo)致原始卵泡的選擇性激活[16]。相反，mTORC2在卵母細(xì)胞中持續(xù)表達以維持卵泡存活，并且當(dāng)mTORC2在拮抗條件下(例如卵毒素誘導(dǎo)的損傷或存活因子缺陷)被抑制時卵泡細(xì)胞凋亡增強[17]。總之，卵母細(xì)胞中的mTORC1信號傳導(dǎo)和mTORC2信號傳導(dǎo)協(xié)同作用以調(diào)節(jié)卵泡激活、發(fā)育和閉鎖。研究表明，Rictor/mTORC2信號通路對于多基因靶向促進小鼠的胎兒生長具有重要調(diào)控作用[18-19]。Rictor可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和代謝，其激活后促進兩個下游靶標(biāo)(即p70核糖體S6激酶1和真核起始因子4E結(jié)合蛋白-1)的磷酸化，并刺激核糖體生物合成和蛋白質(zhì)合成[20]。研究表明，抑制Rictor表達后，小鼠表現(xiàn)出胎盤缺陷和胚胎致死率增加[21-22]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢Rictor、mTORC2 mRNA及蛋白水平降低；模型組、低劑量組、高劑量組、己烯雌酚組Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白表達水平依次升高(P<0.05)。這說明石窯當(dāng)歸提取物能促進Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白表達，激活Rictor/mTORC2信號通路。

綜上所述，石窯當(dāng)歸提取物能改善卵巢早衰大鼠性激素紊亂，促進卵泡發(fā)育、成熟，高劑量的提取物效果更明顯；其機制可能與石窯當(dāng)歸提取物能激活Rictor/mTORC2信號通路有關(guān)。