劉亞東 王蘇和 賀 敏 李麗杰 孫 禹 賀銀鳳*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古包頭市疾病預(yù)防控制中心 內(nèi)蒙古包頭014030）

鉛（Plumbum，Pb）是一種具有多親和性、蓄積性的重金屬，因其對(duì)人和動(dòng)物的造血、神經(jīng)、免疫和生殖系統(tǒng)可造成巨大傷害而受到很多研究人員的關(guān)注[1]。 隨著采礦、冶煉、工業(yè)和交通業(yè)的發(fā)展，大量的重金屬Pb2+被排放到環(huán)境中[2]，其超高的環(huán)境背景值造成的生物濃集現(xiàn)象， 嚴(yán)重威脅著生活在生物鏈頂端的人類健康。

目前，針對(duì)人和動(dòng)物體Pb2+急性中毒，常服用巰基類化合物如二巰基丙醇（BAL）、二巰基丙磺酸鹽（DMPS）、二巰基丁二酸（DMSA）等進(jìn)行解毒，然而緩解Pb2+慢性中毒和蓄積問題仍沒有行之有效的方法。 20 世紀(jì)80年代，在研究啤酒廢棄酵母處理工業(yè)污水時(shí)， 發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對(duì)其中的重金屬Pb2+具備高效的去除能力，隨后在酵母菌的其它種屬[3]耐受和吸附重金屬Pb2+方面也涌現(xiàn)大量報(bào)道。在人類漫漫的文明史上， 酵母菌與人類生活息息相關(guān)，它是食品發(fā)酵中應(yīng)用廣泛、安全的微生物，且易培養(yǎng)、繁殖速度快，有望作為一種新型重金屬生物吸附劑應(yīng)用于人和動(dòng)物。 分離篩選出能夠耐受和吸附重金屬Pb2+的食用安全酵母菌， 對(duì)于后期的研究、應(yīng)用有重要意義。 目前，傳統(tǒng)的方法采用含Pb2+固體培養(yǎng)基劃線/涂布觀察法[4]和搖瓶吸附法[5]篩選可耐受、吸附Pb2+的菌株，試驗(yàn)過程中存在工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力和成本較高等問題。高通量篩選[6-7]是一種基于深孔板（Deep well mi croplates，DWP）的微量、便捷、快速、靈敏的方法。本文基于圓形和方形深孔板建立了一種高通量快速活化、篩選高耐受和高吸附Pb2+菌株的方法，在縮小反應(yīng)體積、節(jié)約成本的同時(shí)，還實(shí)現(xiàn)了高通量的目的。 此外，試驗(yàn)過程中配以多道移液器，大大提高了試驗(yàn)效率， 為快速分離篩選菌株提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品與標(biāo)準(zhǔn)菌株 19 份試驗(yàn)樣品 （土壤、淤泥、污水、羊糞），采集于內(nèi)蒙古包頭鋼鐵廠附近區(qū)域、黃河包頭流段和白云鄂博礦區(qū)。

標(biāo)準(zhǔn)菌株釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）CICC1964，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.1.2 試劑與耗材 硝酸鉛（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯霉素，美國(guó)Sigma 公司；酵母基因組提取試劑盒，天根生化科技公司；dNTPs、ExTaqDNA 聚合酶、6×Loading Buffer，寶生物（大連）工程有限公司； 引 物NL1：5，-GCATAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3， NL4： 5’-GGTC CGTGTTTCAAGACGG-3’，生工生物工程（上海）股份有限公司；24、48 圓孔深孔板， 美國(guó)Corning公司；24、48、96 方孔深孔板和三明治板蓋， 上海甘薇生物科技公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 MBR-022UP 深孔板高速振搖培養(yǎng)器，日本TAITEC 公司；AAS990 火焰原子吸收光譜儀， 北京普析通用公司； 電泳儀， 美國(guó)Bio-Rad 公司；Veriti 96 孔PCR 儀， 美國(guó)Applied Biosystems 公 司；GelDocXR+凝膠成像儀， 美 國(guó)Bio-Rad 公 司；OptionS7+ClassicUVF 超純水系統(tǒng)， 英國(guó)ELGA 公司；F3 型多道 移液器 （30～300μL），美國(guó)Thermo 公司；ePET 型多道電動(dòng)移液器（100～1 200 μL），芬蘭BIOHIT 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品中酵母菌的分離 ①樣品的處理：無菌去除大顆粒后，稱取5 g 樣品（液體樣品吸取5 mL）加入45 mL 生理鹽水中，搖床振蕩1 h（150 r/min，24 ℃）得到樣品懸濁液。②富集：吸取5 mL 樣品懸濁液加入45 mL 的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，水浴搖床5 d （24 ℃/28 ℃，150 r/min），并每12 h 剔除1 次霉菌菌絲球，依上述方法利用YPD 液體培養(yǎng)基進(jìn)行第2 次富集。③分離與純化：挑取2 次富集液劃線于YPD 固體培養(yǎng)基（24 ℃/28 ℃，7 d），每24 h 挑取不同的疑似菌落進(jìn)行1/30 000 美蘭水浸片單細(xì)胞觀察， 將符合酵母菌形態(tài)的菌株繼續(xù)劃線培養(yǎng)，直至得到純培養(yǎng)物，并記錄特征形態(tài)、采集圖像。

1.2.2 高通量快速活化和篩選耐受重金屬Pb2+的酵母菌 基于深孔板對(duì)104 株試驗(yàn)菌株進(jìn)行耐受重金屬Pb2+的高通量活化和篩選， 利用多道移液器在48 孔方形深孔板中加入1.2 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基，按2%比例接種試驗(yàn)菌株，固定三明治板蓋后置于深孔板高速振搖培養(yǎng)器培養(yǎng)10 h（30℃，1 000 r/min），以上述參數(shù)活化二代、三代（8 h、8 h）。

將0.8 mL 含0，1 000，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000，10 000 mg/L 重金屬Pb2+的YPD 固體培養(yǎng)基分別加入48 孔圓形深孔板中，待冷卻凝固后，利用生理鹽水將三代試驗(yàn)菌株稀釋5 倍后接種50 μL 于深孔中（以無菌生理鹽水為空白），置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（濕度80%，溫度30 ℃）中培養(yǎng)5 d。每12 h 觀察記錄一次菌株的生長(zhǎng)情況，第5 天時(shí)拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 高耐受Pb2+酵母菌的馴化 利用含Pb2+連續(xù)培養(yǎng)的方法對(duì)篩選出的15 株耐受重金屬Pb2+的試驗(yàn)菌株進(jìn)行高耐受馴化。 將培養(yǎng)至三代的試驗(yàn)菌株劃線于含1 000 mg/L Pb2+的YPD 固體培養(yǎng)基（24 ℃/28 ℃，重復(fù)兩次），每12 h 觀察一次生長(zhǎng)狀況。 待生長(zhǎng)穩(wěn)定后以1 000 mg/L 的Pb2+濃度為漸進(jìn)梯度，重復(fù)這一過程直至試驗(yàn)菌株不再生長(zhǎng)，所得菌株進(jìn)行含500 mg/L Pb2+的斜面、甘油、真空冷凍干燥保藏， 并利用深孔板含Pb2+固體培養(yǎng)的方法檢測(cè)其對(duì)Pb2+的耐受濃度。

1.2.4 高耐受Pb2+酵母菌的26SrDNA D1/D2 區(qū)域PCR 擴(kuò)增、 序列測(cè)定及分析 將15 株高耐受Pb2+的試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC1964 活化三代后，利用生理鹽水離心（4 000 r/min，4 min）洗滌3次，所得菌泥進(jìn)行液氮研磨[8]后參照酵母菌基因組DNA 提取試劑盒說明書中步驟進(jìn)行總DNA 的提取。參考文獻(xiàn)[9]中方法進(jìn)行26SrDNA D1/D2 區(qū)域的PCR 擴(kuò)增后委托上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用DNAStar 軟件中的 SeqMan 雙向拼接后在GeneBank 中利用BLAST 進(jìn)行同源性序列檢索，選擇Mega7.0 中的鄰接法（Neighbor-Joining）將同源性較高的菌株序列連同試驗(yàn)菌株序列進(jìn)行1 000 次自展（Bootstrap）檢驗(yàn)后繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 基于深孔板高通量吸附法的建立 在24孔圓形、24 孔/48 孔/96 孔方形深孔板中分別加入1.6 mL 的Pb2+（100 mg/L，pH 6.0）儲(chǔ)備液，并將三代試驗(yàn)菌株QF-1-1 的菌懸液以濕重為9 g/L 的比例加入深孔板，利用深孔搖床培養(yǎng)器（30 ℃，600 r/min）振蕩50 min，吸附液離心（14 000 r/min，4 min）取上清，利用火焰原子吸收光譜法檢測(cè)其中Pb2+的量。

在篩選出的48 孔方形深孔板中加入1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL 的Pb2+（100 mg/L，pH 6.0）儲(chǔ)備液，以濕重為9 g/L 的比例將QF-1-1 菌懸液加入深孔板，利用深孔搖床培養(yǎng)器（30 ℃）在轉(zhuǎn)速600，800，1 000，1 200，1 400 r/min 下振蕩50 min；另在50 mL 三角瓶中加入20 mL 的Pb2+（100 mg/L，pH 6.0）儲(chǔ)備液，以濕重為9 g/L 的比例將QF-1-1 菌懸液加入三角瓶，振蕩（30 ℃，150 r/min）50 min。吸附液離心（14 000 r/min，4 min）取上清，利用火焰原子吸收光譜法檢測(cè)其中Pb2+的量。

1.2.6 高通量篩選吸附Pb2+的菌株及馴化前后吸附能力的變化 選取經(jīng)Pb2+馴化前、 后可安全用于人和動(dòng)物的18 株菌株[10～12]，活化三代后利用基于深孔板建立的高通量吸附法進(jìn)行對(duì)100 mg/L、pH 6.0 重金屬Pb2+溶液的吸附試驗(yàn)。

在48 孔方形深孔板中加入1.4 mL 的Pb2+（100 mg/L，pH 6.0）儲(chǔ)備液，將三代菌液經(jīng)超純水離心（4 000 r/min，4 min）洗滌3 次后制成菌懸液，以濕重為9 g/L 的比例加入深孔，利用深孔搖床培養(yǎng)器（30 ℃，800 r/min）振蕩50 min，吸附液離心（14 000 r/min，4 min）取上清，利用火焰原子吸收光譜法檢測(cè)其中Pb2+的量。

1.2.7 重金屬Pb2+吸附量和去除率的計(jì)算方法及數(shù)據(jù)分析 繪制火焰原子吸收光譜法的Pb2+溶液濃度（橫坐標(biāo)軸）- 吸光度值（縱坐標(biāo)軸）標(biāo)準(zhǔn)曲線I（圖1）、II（圖2），并求得線性回歸方程。 結(jié)果表明， 在火焰原子吸收光譜儀下吸光度值分別在0.040～0.250（圖1）、0.173～0.665（圖2）間與Pb2+溶液濃度具有良好的線性關(guān)系， 即線性檢測(cè)范圍為5～100 mg/L。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線IFig.1 Standard curve I

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線IIFig.2 Standard curve II

根據(jù)樣品測(cè)定得到的吸光度值， 選擇線性回歸方程求出Pb2+的含量， 并利用如下公式進(jìn)行吸附量An（mg/g 濕菌重）和去除率Re 的計(jì)算。

式中：b——未接種酵母菌處理溶液中的Pb2+含量 （mg）；c——酵母處理后溶液中的Pb2+含量（mg）；d——酵母菌的添加量（g）。

以上試驗(yàn)兩個(gè)平行5 次重復(fù)， 利用Spss20.0進(jìn)行顯著性分析，Excel 進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高耐受重金屬Pb2+酵母菌的高通量分離篩選結(jié)果

19 份來自重金屬污染區(qū)的樣品經(jīng)2 次選擇性富集后共分得104 株酵母菌， 觀察圖3 可知分別從土壤、礦渣、污泥/污水、羊糞中分得57，2，36，9 株菌株，其中包頭鋼鐵廠、黃河包頭流段、白云鄂博礦區(qū)各分得77，7，20 株菌株。

菌株面臨高濃度Pb2+脅迫時(shí)的生長(zhǎng)繁殖情況，會(huì)直接影響其在人和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮吸附特性，將104 株菌株利用深孔板含Pb2+固體培養(yǎng)的方法進(jìn)行高通量耐受篩選，結(jié)果見圖4。 觀察圖4 可發(fā)現(xiàn)， 試驗(yàn)菌株在<3 000 mg/L Pb2+質(zhì)量濃度時(shí)均可較好的生長(zhǎng)， 隨著Pb2+質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加可耐受菌株數(shù)量開始急劇下降但是當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度達(dá)到5 000，6 000，7 000，8 000 mg/L 時(shí)仍分別有26，12，3，2 株菌株可耐受， 這可能是因?yàn)闃悠分械木觊L(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖于重金屬污染區(qū)， 對(duì)一定濃度范圍的Pb2+具備耐受能力， 但是個(gè)體菌株因代謝等方面的差異造成耐受能力的高低， 選取其中可耐受6 000 mg/L 以上的菌株和篩選試驗(yàn)中菌斑顏色變?yōu)楹诤稚?5 株菌株進(jìn)行鑒定。

圖3 不同來源和種類樣品中酵母菌的分離結(jié)果Fig.3 Separation of yeast from different sources and species of samples

2.2 基于高耐受重金屬Pb2+試驗(yàn)菌株26SrDNA D1/D2 區(qū)域序列的鑒定結(jié)果

將15 株高耐受重金屬Pb2+的試驗(yàn)菌株和1株標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC1964 的D1/D2 區(qū)序列在GeneBank 中進(jìn)行同源性序列檢索后， 利用Mega 7.0 中的鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行1 000 次自展（Bootstrap）檢驗(yàn)后繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。

根據(jù)同一菌種內(nèi)不同菌株酵母菌D1/D2 區(qū)域的堿基差異不超過1%， 觀察圖5 可將16 株菌株歸為8 個(gè)屬10 個(gè)種， 其中，QI-1-6、QI-1-7、QF-1-1、QD-2-8 與異常威克漢姆酵母CBS：2870 在同一分支，同源性均為100%，可鑒定為異常威克漢姆酵母；QD-2-5 與Candida palmioleophila Y-17323 在同一分支， 同源性為100%， 可鑒定為Candida palmioleophila；HD-1-4 與熱帶假絲酵母WIN（Candida tropicalis WIN）在同一分支，同源性為100%，可鑒定為熱帶假絲酵母；QE-1-4 與地霉半乳糖酵母LMA-74 （Galactomyces geotrichum LMA-74）在同一分支，同源性為100%，可鑒定為地霉半乳糖酵母；QE-1-5 與山梨假絲酵母CBS：7266（Candida sorbophila CBS：7266）在同一分支，同源性為99.75%， 可鑒定為山梨假絲酵母；QH-1-2 與阿德利長(zhǎng)西氏酵母RY25（Naganishia adeliensis RY25）在同一分支，同源性為99.50%，可鑒定為阿德利長(zhǎng)西氏酵母；QE-1-1-2、QK-1-5與金佩梅奇酵母Do127 在同一分支，同源性分別為99.20%，99.60%， 可鑒定為金佩梅奇酵母；QJ-1-2、QD-2-6、QA-2-1 與膠紅酵母CBS：482 在同一分支， 同源性均為100%， 可鑒定為膠紅酵母；QG-1-2 與Basidioascus persicus 在同一分支，同源性100%，可鑒定為Basidioascus persicus；此外，參考菌株CICC1964 與釀酒酵母HNN11516（Saccharomyces cerevisiae HNN11516）在同一分支，同源性100%，可鑒定為釀酒酵母，與已知相符，說明鑒定結(jié)果可信。

圖4 不同質(zhì)量濃度Pb2+脅迫下試驗(yàn)菌株耐受株數(shù)Fig.4 Different concentrations of Pb2+ test strains tolerance number

選取食品和飼料發(fā)酵中常用的異常威克漢姆酵母[10]QI-1-6、QI-1-7、QF-1-1、QD-2-8，金佩梅奇酵母[11]QE-1-12、QK-1-5，膠紅酵母[12]QJ-1-2、QD-2-6、QA-2-1 共9 株酵母菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 試驗(yàn)菌株耐受重金屬Pb2+的馴化結(jié)果

圖5 基于試驗(yàn)菌株26SrDNA D1/D2 區(qū)域序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the region sequence of the 26SrDNA D1/D2

圖6 膠紅酵母QJ-1-2 馴化前后對(duì)Pb2+耐受性的高通量評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.6 High-throughput evaluation of Pb2+ tolerance before and after acclimation of Rhodotorula mucilaginosa QJ-1-2

9 株試驗(yàn)菌株經(jīng)1 000 mg/L 的重金屬Pb2+為漸進(jìn)梯度馴化前后， 利用深孔板含Pb2+固體培養(yǎng)的方法進(jìn)行耐受性的高通量評(píng)價(jià)， 選取其中一株QJ-1-2 的高通量評(píng)價(jià)圖為例進(jìn)行分析可發(fā)現(xiàn)，圖6 中菌株馴化前在<4 000 mg/L Pb2+時(shí)可正常生長(zhǎng)，隨著Pb2+濃度升高生長(zhǎng)開始受到抑制，在質(zhì)量濃度為6 000 mg/L 時(shí)停止生長(zhǎng)；馴化后與之相比，菌株在<7 000 mg/L Pb2+時(shí)仍可正常生長(zhǎng)， 直至10 000 mg/L Pb2+時(shí)生長(zhǎng)停止。 綜上，菌株QJ-1-2對(duì)Pb2+的耐受能力馴化前、 后分別為6 000 和10 000 mg/L， 馴化后的耐受能力得到了較大的提升，與傳統(tǒng)的劃線/涂布培養(yǎng)觀察法[5-6]相比，操作簡(jiǎn)單快速、大大減少了工作量和試劑耗材應(yīng)用，且試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果較直觀、易觀察分析。

圖7 試驗(yàn)菌株經(jīng)馴化前后的Pb2+耐受質(zhì)量濃度Fig.7 Pb2+ tolerance concentration of test strains before and after acclimation

觀察圖7 可知， 馴化前9 株試驗(yàn)菌株對(duì)Pb2+均有不同程度的耐受性， 其中同屬種菌株表現(xiàn)出相似耐受性，金佩梅奇酵母（M.chrysoperlae）QE-1-12、QK-1-5 的耐受質(zhì)量濃度為4 000 mg/L，膠紅酵母（R.mucilaginosa）QA-2-1、QD-2-6、QJ-1-2的耐受質(zhì)量濃度分別為5 000，6 000，6 000 mg/L，異常威克漢姆酵母 （W.anomalus）QF-1-1、QI-1-6、QI-1-7、QD-2-8 耐受質(zhì)量濃度分別為6 000，6 000，7 000，6 000 mg/L； 此外不同屬種表現(xiàn)為異常威克漢姆酵母（W.anomalus）、膠紅酵母（R.mucilaginosa）高耐性可達(dá)5 000～7 000 mg/L 的Pb2+質(zhì)量濃度，而金佩梅奇酵母（M.chrysoperlae）的耐受性較弱僅為4 000 mg/L 的Pb2+質(zhì)量濃度。

經(jīng)馴化后，9 株試驗(yàn)菌株對(duì)Pb2+的耐受能力均有所提高， 其中以膠紅酵母和異常威克漢姆酵母最為突出達(dá)到了8 000～10 000 mg/L， 金佩梅奇酵母達(dá)到了5 000～6 000 mg/L。 高濃度重金屬Pb2+對(duì)酵母菌生長(zhǎng)繁殖的抑制作用主要表現(xiàn)為可造成胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝通路受阻， 使正常生理功能受到嚴(yán)重影響； 此外，Pb2+對(duì)酵母菌的脅迫會(huì)使其胞內(nèi)的ROS 升高[13]，超常量具備高反應(yīng)活性的ROS 將破壞其細(xì)胞膜[14]并激活下游凋亡途徑[15]，致死。 試驗(yàn)結(jié)果中菌株經(jīng)馴化后對(duì)Pb2+耐受性的升高， 可能是因?yàn)榫暝诳赡褪躊b2+濃度下連續(xù)培養(yǎng)使得細(xì)胞的無機(jī)微沉淀作用[20]有所提高，此外，胞內(nèi)的重金屬螯合肽、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[16]和抗氧化應(yīng)激酶類表達(dá)量升高，使得胞內(nèi)螯合[19]、主動(dòng)外排[16]和細(xì)胞器區(qū)隔作用[17]增大，胞內(nèi)毒性狀態(tài)Pb2+減少，同時(shí)ROS的去除效率得到了提高， 從而增強(qiáng)了對(duì)重金屬Pb2+的耐受性。

2.4 高通量吸附法的深孔板篩選和條件優(yōu)化結(jié)果

選取不同孔型和容積的深孔板， 在同一加樣體積、轉(zhuǎn)速以及吸附條件下以菌株QF-1-1 為例，研究對(duì)其吸附重金屬Pb2+量的影響。 觀察圖8 可發(fā)現(xiàn)， 不同孔型和容積對(duì)菌株QF-1-1 吸附重金屬Pb2+的量均存在一定的影響，其中24 孔圓孔和48 孔方孔的吸附效果最好， 吸附量分別為3.66，4.11 mg/g（濕菌重），差異性不顯著（P>0.05），但因24 孔圓孔的通量較低， 故而后續(xù)試驗(yàn)選取48 孔方形深孔板進(jìn)行。

試驗(yàn)菌株吸附的過程中菌體細(xì)胞與重金屬Pb2+必須保持充分接觸，所以吸附體積與轉(zhuǎn)速會(huì)在一定程度上影響菌株QF-1-1 吸附重金屬Pb2+的量。 分析比對(duì)表1 中結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吸附體積為1.4 mL，轉(zhuǎn)速為800 r/min 時(shí)，菌株QF-1-1 對(duì)重金屬Pb2+的吸附量達(dá)到最大值8.94 mg/g 濕菌重；當(dāng)轉(zhuǎn)速<1 400 r/min 時(shí)，同一轉(zhuǎn)速下，隨著吸附體積的升高對(duì)Pb2+的吸附量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)， 如1 000 r/min 時(shí)，1.2，1.4，1.6，1.8 mL 的吸附量分別為5.95，6.07，5.87，5.84 mg/g （濕菌重），然而轉(zhuǎn)速為1 400 r/min 時(shí)， 隨著吸附體積的升高不具備規(guī)律性；當(dāng)吸附體積相同時(shí)，菌株QF-1-1 對(duì)重金屬Pb2+的吸附量隨著轉(zhuǎn)速增加呈現(xiàn)出同樣先上升后下降的趨勢(shì)，如1.2 mL 時(shí)，600，800，1 000，1 200 r/min 的菌株吸附量分別為4.86，7.08，5.95，5.87 mg/g（濕菌重），這一現(xiàn)象可能因?yàn)椴煌w積的充分振蕩所需要的力不同， 當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時(shí)液體的振幅過大在孔內(nèi)容易形成貼壁的空懸狀態(tài)，反而會(huì)影響菌體與Pb2+的接觸，造成吸附量的下降。

菌株QF-1-1 利用基于深孔板經(jīng)優(yōu)化后的高通量吸附法對(duì)重金屬Pb2+的吸附量可達(dá)到8.94 mg/g（濕菌重，見表1），此時(shí)與傳統(tǒng)的搖瓶法8.44 mg/g（濕菌重）的吸附量相比較（圖9）差異性不顯著 （P>0.05）。 傳統(tǒng)搖瓶吸附法的吸附體系為20 mL，與之相比深孔板法僅為1.4 mL，在縮小反應(yīng)體積、節(jié)約資源和菌體使用量的同時(shí)，試驗(yàn)中配以多道移液器可大大減輕人力勞動(dòng)，達(dá)到高通量、快速便捷的目的， 為生物吸附重金屬離子的篩選和吸附特性等研究提供了一種新思路。

圖8 不同類型深孔板對(duì)菌株QF-1-1 吸附Pb2+量的影響結(jié)果Fig.8 Effect of different types of Deep-well Plate on the adsorption of Pb2+ on strain QF-1-1

圖9 基于不同吸附方法的菌株QF-1-1 吸附Pb2+量對(duì)比結(jié)果Fig.9 Adsorption of Pb2+ on strain QF-1-1 based on different adsorption methods

表1 基于深孔板的高通量吸附法條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimization results based on high-throughput adsorption method based on Deep-well Plate

2.5 基于高通量吸附法馴化前后試驗(yàn)菌株對(duì)重金屬Pb2+的去除率變化

將經(jīng)重金屬Pb2+馴化前后的18 株菌株，利用高通量深孔板吸附法進(jìn)行吸附試驗(yàn)， 所得去除率結(jié)果如圖10 所示。 觀察圖10 中試驗(yàn)菌株馴化前的去除率可知， 同屬種菌株對(duì)重金屬Pb2+表現(xiàn)出相似的吸附性。 2 株金佩梅奇酵母去除率分別為92.56%，95.45%，4 株異常威克漢姆酵母的去除率在78.94%～90.38%之間，均表現(xiàn)出較高的吸附性，然而，3 株膠紅酵母的吸附性均較低，最高的QA-2-1 僅為23.14%。

觀察對(duì)比試驗(yàn)菌株馴化前和馴化后的圖10去除率和圖7 耐受性結(jié)果可知， 經(jīng)重金屬Pb2+馴化后雖然耐受性均有提高， 但是Pb2+的去除率1株未發(fā)生變化，5 株發(fā)生下降，3 株有所提高。 其中，1 株金佩梅奇酵母QE-1-12 經(jīng)馴化后對(duì)Pb2+的去除率未發(fā)生變化；此外，經(jīng)馴化后金佩梅奇酵母QK-1-5 Pb2+的去除率從95.45%降至90.06%，異常威克漢姆酵母QF-1-1、QI-1-6 從89.67%，80.1%分別降至77.93%，45.46%，膠紅酵母QA-2-1、QJ-1-2 從23.14%，15.97 分別降至18.36%，14.52%，然而異常威克漢姆酵母QD28、QI-1-7 和膠紅酵母QD-2-6 的Pb2+去除率卻有所提高，分別從90.38%，78.94%，15.85%升高到95.96%，91.35%，16.99%。

圖10 馴化前后的試驗(yàn)菌株對(duì)重金屬Pb2+的去除率變化Fig.10 Changes in the removal rate of heavy metal Pb2+ by experimental strains before and after acclimatization

2.6 試驗(yàn)菌株對(duì)重金屬Pb2+的耐受性與吸附性之間的關(guān)系

觀察試驗(yàn)菌株對(duì)Pb2+的圖7 耐受性和圖10去除率可發(fā)現(xiàn)， 試驗(yàn)菌株對(duì)Pb2+的耐受性與其吸附性間不存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系， 高耐受Pb2+的4株異常維克漢姆酵母QI-1-6、QI-1-7、QF-1-1、QD-2-8 對(duì)Pb2+存在較高的去除率 （78.94%～90.38%），然而同樣高耐受的3 株膠紅酵母QJ-1-2、QD-2-6、QA-2-1 對(duì)Pb2+的去除率最高僅為23.14%，此外，低耐受Pb2+的2 株梅奇酵母QE-1-12、QK-1-5 對(duì)Pb2+的去除率卻高達(dá)92.56%以上。綜上， 菌株對(duì)重金屬Pb2+的耐受性和吸附性間并不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，具體可表現(xiàn)為高耐受高吸附、高耐受低吸附、 低耐受高吸附幾種情況， 酵母菌對(duì)Pb2+的胞內(nèi)累積[18-19]、胞外沉淀[20]和主動(dòng)外排系統(tǒng)[16]可能是造成這一現(xiàn)象的主要原因。 菌株在后續(xù)的研究中期望作為重金屬生物吸附劑應(yīng)用到人和動(dòng)物，除了要保持較高的重金屬吸附能力外，脅迫時(shí)能否具有較好的耐受能力并保持一定的生理活性也非常重要， 所以本試驗(yàn)中高耐受高吸附型的4株異常威克漢姆酵母，具備較大的研究應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

19 份來自內(nèi)蒙古重金屬污染區(qū)的樣品共分離出104 株酵母菌，經(jīng)高通量篩選表明：（1）26 株對(duì)Pb2+的耐受質(zhì)量濃度在5 000 mg/L 以上， 選取15 株高耐受菌株經(jīng)26SrDNA 基因片段分析鑒定為7 屬9 種，分別為Candida palmioleophila、熱帶假絲酵母、地霉半乳糖酵母、山梨假絲酵母、阿德利長(zhǎng)西氏酵母、 Basidioascus persicus，此外，其中4 株異常威克漢姆酵母、3 株膠紅酵母、2 株金佩梅奇酵母是常應(yīng)用于人和動(dòng)物的菌種。 （2）9 株常用菌株中同屬種菌株對(duì)Pb2+表現(xiàn)出相似耐受性，其中異常威克漢姆酵母、膠紅酵母表現(xiàn)為高耐性，而梅奇酵母的耐受性較弱；經(jīng)馴化，耐受能力均有所提高， 其中以膠紅酵母和異常威克漢姆酵母最為顯著達(dá)到了8 000～10 000 mg/L， 金佩梅奇酵母達(dá)到了5 000～6 000 mg/L。 （3）48 孔方形深孔板吸附體積為1.4 mL，轉(zhuǎn)速為800 r/min 時(shí)的吸附量可達(dá)到與搖瓶吸附量相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果， 同時(shí)發(fā)現(xiàn)9 株菌株中同屬種菌株對(duì)Pb2+表現(xiàn)出相似的吸附性，經(jīng)耐受Pb2+的馴化后，對(duì)Pb2+的去除率1 株未發(fā)生變化，5 株發(fā)生下降，3 株有所提高。 （4）9 株菌株的耐受性與其吸附性之間不存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，低耐受Pb2+的2 株梅奇酵母去除率高達(dá)92.56%以上， 而高耐受的3 株膠紅酵母對(duì)Pb2+的去除率最高卻僅為23.14%，只有4 株異常威克漢姆酵母對(duì)重金屬Pb2+的耐受質(zhì)量濃度在6 000～7 000 mg/L之間，去除率同樣可達(dá)到78.94%～91.67%，具備一定的研究應(yīng)用潛力。 文中建立的高通量篩選方法也可應(yīng)用于其它微生物耐受和吸附重金屬離子的篩選試驗(yàn)中。