姚一博，王迪，王錢(qián)陶，肖長(zhǎng)芳，梁宏濤，曹永清，陸金根，王琛

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肛腸科，上海 200032)

慢性傳輸型便秘是一種以腸道內(nèi)糞便的傳輸過(guò)程緩慢為主要特點(diǎn)的功能性疾病，常常表現(xiàn)為大便干結(jié)、排便次數(shù)減少、排便敏感性下降并伴隨有腹痛、腹脹等癥狀[1]。 據(jù)最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球的發(fā)病率為14%，其中成年人慢性便秘的患病率在2.5% ～79%之間[1-2]。 在美國(guó)，每年有310 萬(wàn)便秘患者就診，造成了沉重的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]；而在中國(guó)，慢性傳輸型便秘也是一個(gè)常見(jiàn)疾病，并可嚴(yán)重影響成年人生活質(zhì)量[5]。 近年來(lái)，慢傳輸型便秘的發(fā)病率逐漸增高，嚴(yán)重的威脅人類(lèi)的健康和生活質(zhì)量[6-7]。 因此，慢傳輸型便秘臨床治療和機(jī)制的研究刻不容緩。

動(dòng)物模型在慢傳輸型便秘機(jī)制研究中扮演重要的角色，不同的研究目的對(duì)于造模動(dòng)物的選擇、造模方法都各不相同。 因此，建立與人便秘有共同的病理生理變化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)于探索便秘的發(fā)病機(jī)制、新的治療途徑都有著重要意義[8]。 藥物造模是慢傳輸型便秘造模的主要方式，常用的藥物有鹽酸洛哌丁胺(Loperamide hydrochloride)[9]。 鹽酸洛哌丁胺是一種外周性阿片受體激動(dòng)劑[10]，機(jī)制是抑制腸道水分泌和結(jié)腸蠕動(dòng)，延遲糞便疏散時(shí)間和腸腔運(yùn)輸，通過(guò)減少動(dòng)物的糞便顆粒數(shù)量，重量和含水量而出現(xiàn)便秘癥狀[9-11]。 然而，造模藥物的劑量、造模時(shí)間的差別會(huì)直接影響模型成功率[12]。因此，本研究重點(diǎn)探討造模藥物鹽酸洛哌丁胺不同劑量、不同給藥時(shí)間對(duì)于慢傳輸型便秘小鼠動(dòng)物模型的影響，探索建立穩(wěn)定的洛哌丁胺誘導(dǎo)的慢傳輸小鼠便秘模型各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～8 周SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6 小鼠72 只，體重(25 ± 5)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2018-0003】。 動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(滬)2014-0008】。 飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22 ～25℃。 所有操作均符合上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號(hào)：IACUC PZSHUTCM200104005)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸洛哌丁胺 (Loperamide HCl) 50 mg(SELLECK，S2480)；印度墨水(源葉生物科技科技有限公司，S30881)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備

鹽酸洛哌丁胺選取0.5 mg/kg、5 mg/kg 和50 mg/kg 三個(gè)劑量，使用無(wú)菌性生理鹽水配制藥物濃度分別0.025 mg/mL、0.25 mg/mL 和2.5 mg/mL 的鹽酸洛哌丁胺混懸液。

1.2.2 造模方法

配制鹽酸洛哌丁胺溶液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，給藥時(shí)間為每日上午9 時(shí)和下午3 時(shí)分兩次給藥，給藥體積為每10 g 小鼠體重0.2 mL。

1.2.3 腸道推進(jìn)率檢測(cè)

造模完成后，小鼠禁食過(guò)夜以排空腸內(nèi)容物。至第2 天上午開(kāi)始進(jìn)行小鼠腸道推進(jìn)率檢測(cè)。 具體方法為：每只小鼠經(jīng)口灌0.2 mL 印度墨水，20 min后脫頸椎處死。 迅速打開(kāi)小鼠腹腔，取出自幽門(mén)至肛門(mén)的全腸道，無(wú)張力拉直后測(cè)量腸道全長(zhǎng)L1；然后再測(cè)量墨汁在腸道內(nèi)的行進(jìn)長(zhǎng)度L2，計(jì)算小鼠腸道推進(jìn)率D=L2/L1×100%。

1.2.4 排便量檢測(cè)

每日上午給藥后，更換新籠盒，至下午給藥之前，收集小鼠兩次給藥間期的糞便，并稱重、記錄糞便濕重W1，以比較組間排便量差異；然后將各組小鼠的糞便放入鼓風(fēng)機(jī)內(nèi)進(jìn)行高溫烘干、脫水。 鼓風(fēng)機(jī)設(shè)置為100℃，連續(xù)烘干2 h，再次進(jìn)行稱重，記錄干重W2；計(jì)算小鼠的糞便含水率R=(W1-W2)/W1×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理與分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間樣本均數(shù)多重比較，若方差齊采用LSD，若方差不齊采用Games-Howell 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 造模動(dòng)物的一般情況

造模大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少和毛發(fā)光澤減退現(xiàn)象，體質(zhì)量增長(zhǎng)慢于對(duì)照組，飲水量正常，部分出現(xiàn)進(jìn)食和尿量減少。

2.2 不同鹽酸洛哌丁胺給藥劑量對(duì)于小鼠便秘慢傳輸型便秘模型的影響

每組8 只小鼠，按照鹽酸洛哌丁胺的不同給藥劑量及濃度梯度，分為四組空白組、低劑量組0.5 mg/kg、中劑量組5 mg/kg、高劑量組50 mg/kg；為避免灌胃劑量過(guò)大，按照給藥體積為每10 g 小鼠體重灌胃0.2 mL 進(jìn)行給藥，每日上午9 時(shí)和下午3 時(shí)進(jìn)行給藥，給藥時(shí)間15 d。 通過(guò)比較組間腸道推進(jìn)率的方法驗(yàn)證造模結(jié)果，結(jié)果表明50 mg/kg 組小鼠腸道推進(jìn)率與空白組相比顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.05)。 (圖1)

2.3 不同造模天數(shù)對(duì)小鼠腸道推進(jìn)率以及排便量變化

每組8 只小鼠，采用前期試驗(yàn)中驗(yàn)證的最有效劑量是50 mg/kg，藥物配制方法同上；給藥體積0.2 mL/10 g，給藥時(shí)間為上午9 時(shí)，下午3 時(shí)；將造模天數(shù)分為3 d 組、7 d 組、10 d 組和14 d 組。 如圖2 所示，小鼠腸道推進(jìn)率檢測(cè)，造模第7 天時(shí)，小鼠的腸道推進(jìn)率與空白組相比明顯降低(P＜0.05)；而造模3、10、14 d 腸道推進(jìn)率與空白組相比，差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。

如圖3 所示，觀察收集小鼠的糞便稱重，監(jiān)測(cè)小鼠每天的排便量變化，各模型組小鼠隨著給藥天數(shù)的不斷增加，排便量呈現(xiàn)先減少而后再增加的趨勢(shì)。 造模3、7、10、14 d 后，小鼠排便量與空白組相比，差異均具有顯著性(P＜0.05)。

圖1 不同劑量鹽酸洛哌丁胺對(duì)小鼠腸道推進(jìn)率的影響Note. There was significant difference in intestinal propulsion rate between 50 mg/kg group and blank group，*P＜0.05.Figure 1 Effects of different doses of loperamide hydrochloride on intestinal propulsive rate in mice

圖2 鹽酸洛哌丁胺不同造模時(shí)間對(duì)小鼠腸道推進(jìn)率影響Note. The effect of loperamide hydrochloride on intestinal propulsive rate was significantly different from that of the blank group，*P＜0.05.Figure 2 Effects of loperamide hydrochloride on intestinal propulsive rate in mice with different modeling time

3 討論

本文通過(guò)鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)小鼠慢傳輸型便秘模型，觀察不同劑量、不同給藥時(shí)間對(duì)于小鼠便秘模型的影響。 鹽酸洛哌丁胺是一種外周性阿片受體激動(dòng)劑，已廣泛用于建立便秘動(dòng)物模型[13-17]。主要通過(guò)作用于腸道縱行肌層的肌間神經(jīng)叢來(lái)降低腸道的推動(dòng)作用[18-19]，或者通過(guò)刺激吸收和鈣調(diào)素拮抗介導(dǎo)的抗分泌作用來(lái)調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)的腸道運(yùn)輸[20-22]，也可在肌間神經(jīng)叢水平作用于阿片受體，從而降低腸蠕動(dòng)[23]。 鹽酸洛哌丁胺減少了便秘動(dòng)物的攝水量，減少糞粒含水量，但不會(huì)影響動(dòng)物的攝食，符合人類(lèi)便秘的臨床表現(xiàn)[18，24]。 其藥理學(xué)機(jī)制提示，在腸道中它具有通過(guò)阿片受體和非阿片受體機(jī)制介導(dǎo)的抗分泌作用和影響腸動(dòng)力的作用。在較高劑量下，通過(guò)腸肌間神經(jīng)叢中的阿片受體介導(dǎo)而降低腸動(dòng)力。 說(shuō)明可能存在兩種機(jī)制：低劑量可發(fā)揮抗分泌作用，高劑量可發(fā)揮影響腸動(dòng)力的作用[19]。 總之，鹽酸洛哌丁胺復(fù)雜的劑量差異性藥理學(xué)機(jī)制，提示小鼠便秘模型的建立，更加需要注意給藥劑量和時(shí)間。 因此確定鹽酸洛哌丁胺的最有效造模劑量，誘導(dǎo)建立穩(wěn)定、可以重復(fù)的慢傳輸型便秘模型，已成為實(shí)驗(yàn)研究體系不可缺少的一部分。

便秘模型建立中，鹽酸洛哌丁胺給藥的劑量不盡相同，文獻(xiàn)報(bào)道藥物劑量范圍從2.1 mg ～20 mg/kg不等[20-22，25]。 如采用4 mg/kg 連續(xù)給藥3 d，停藥3 d 后，繼續(xù)不同濃度4 mg/kg 和8 mg/kg 連續(xù)給藥4 d，建立了穩(wěn)定的便秘模型，并發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物組織PKC 磷酸化表達(dá)存在差異[20]；如果造模采用9.38 mg/kg 給藥，并且首次給藥劑量翻倍，連續(xù)給藥10 d，模型小鼠出現(xiàn)結(jié)腸粘膜層變薄，遠(yuǎn)端結(jié)腸杯狀細(xì)胞體積變小等細(xì)胞形態(tài)變化[26-27]。 本研究對(duì)比同樣的給藥模式不同劑量的鹽酸洛哌丁胺造模的效果，在0.5 ～50 mg/kg 的劑量濃度范圍內(nèi)，選擇0.5 mg/kg、5.0 mg/kg、50 mg/kg 三個(gè)不同的給藥濃度，檢測(cè)給藥后腸道推進(jìn)率、排便量及糞便含水率三個(gè)指標(biāo)，觀察不同濃度的鹽酸洛哌丁胺對(duì)于腸道推進(jìn)率的影響。 研究發(fā)現(xiàn)：在0.5 ～50 mg/kg 的給藥濃度范圍內(nèi)，通過(guò)比較組間腸道推進(jìn)率，50 mg/kg 組與空白組相比，小鼠腸道推進(jìn)率顯著降低、排便量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 本次研究中糞便的含水率與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 由于小鼠有隨時(shí)排便的習(xí)性，糞便含水量易受多種因素影響[28]。 同時(shí)觀察不同濃度給藥后小鼠狀態(tài)和耐受性，造模過(guò)程中過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)體重下降、精神不濟(jì)甚至死亡的現(xiàn)象。 本次研究認(rèn)為50 mg/kg 的劑量是能夠造模成功的最大穩(wěn)定劑量。

不同的給藥時(shí)間在小鼠慢傳輸型便秘模型的造模中也是重要的影響因素之一，文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于造模天數(shù)從3 ～42 d 不等[25-27，29-32]。 采用鹽酸洛哌丁胺造模后第5 天，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠糞便含水量下降，小腸推進(jìn)率降低，結(jié)腸組織中SP、5-HT 減少[17]。而連續(xù)給藥后第10 天，停藥后再連續(xù)觀察7 d，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸HE 染色提示腸粘膜層變薄、腸內(nèi)細(xì)胞形態(tài)與空白組相比變得小而細(xì)長(zhǎng)，口肛傳輸時(shí)間延長(zhǎng)等變化[26]。 而在模擬體虛便秘模型造模中采用鹽酸洛哌丁胺10 mg/kg 連續(xù)給藥42 d，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組比較，模型組近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP2 的表達(dá)水平增加，這一結(jié)果可能使結(jié)腸水分重吸收增多而黏液分泌減少而導(dǎo)致腸動(dòng)力下降[32]。上述結(jié)果共同提示采用鹽酸洛哌丁胺建立小鼠便秘模型，造模時(shí)間以及觀察時(shí)間也是決定模型是否成功的關(guān)鍵因素。

本研究我們?cè)? ～14 d 的時(shí)間范圍內(nèi)，設(shè)立了3、7、10 和14 d 四個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)造模時(shí)間進(jìn)行了橫向?qū)Ρ取?造模第7 天時(shí)，小鼠的腸道推進(jìn)率與空白組相比明顯降低(P＜0.05)；而3、10、14 d腸道推進(jìn)率相比無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 研究發(fā)現(xiàn)隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽酸洛哌丁胺對(duì)于小鼠腸道的抑制作用反而減弱甚至消失，鹽酸洛哌丁胺給藥10 d以上，小鼠的腸道推動(dòng)功能與空白組相比，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 鹽酸洛哌丁胺對(duì)小鼠腸道推動(dòng)功能的抑制也未呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系。 對(duì)比不同給藥時(shí)間和給藥劑量對(duì)小鼠的腸道推動(dòng)力發(fā)現(xiàn)，鹽酸洛哌丁胺對(duì)小鼠腸道的抑制功能與時(shí)間和劑量均不成正相關(guān)。 鹽酸洛哌丁胺作為阿片受體激動(dòng)劑長(zhǎng)時(shí)間使用存在耐藥可能[33]。 文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸洛哌丁胺隨著給藥劑量的增加(0.1 ～30 mg/kg)，小鼠腸道推進(jìn)率不斷下降；給藥1 ～2 d 小鼠腸道推進(jìn)率下降30%，給藥第3 天腸道推進(jìn)率開(kāi)始恢復(fù)到60%，提示連續(xù)給藥大于3 d，鹽酸洛哌丁胺對(duì)于腸道傳輸功能的抑制作用減弱[34-36]。 同樣在預(yù)初實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)小鼠排便量隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)7、14、25 d，小鼠的排便量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 實(shí)驗(yàn)中采用鹽酸洛哌丁胺50 mg/kg 濃度制備小鼠便秘模型，連續(xù)給藥小于7 d，腸道推進(jìn)率顯著降低82%、77%；繼續(xù)給藥10、14 d)腸道推進(jìn)率逐漸恢復(fù)到88%、86%。 依據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及上述情況，我們推測(cè)鹽酸洛哌丁胺藥物作用可能存在效應(yīng)平臺(tái)期，給藥時(shí)間大于7 d，對(duì)腸道推進(jìn)功能的抑制作用減弱。

綜上，本研究采用50 mg/kg 劑量連續(xù)灌胃7 d，可使小鼠的腸道推進(jìn)率顯著降低，排便量明顯減少，能夠制造相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)腸傳輸障礙型便秘小鼠模型。 實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)體重下降等異?，F(xiàn)象，進(jìn)一步為鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)慢傳輸型便秘模型的探索提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。