張欣，楊英，安曉羽，2，谷艷琪，張引，麻炎，孫利婷，林芳，武強強，2，王亞娜，2，楊慧娣*

肥胖已成為世界范圍內(nèi)一個嚴(yán)重的健康問題[1]。 全球趨勢顯示，肥胖癥在所有年齡組中的流行率都在上升。 肥胖的特點是白色脂肪組織過度積累，并與代謝疾病發(fā)生有關(guān)。 肥胖會導(dǎo)致脂肪組織發(fā)生低度炎癥，并且可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，如，胰島素抵抗和II 型糖尿病[2]。 大量的研究表明，肥胖時，促炎癥細胞因子的分泌增加，如白細胞介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，和瘦素(Leptin)。 而抗炎因子的分泌減少，如脂聯(lián)素(adiponectin)和白介素10(IL-10)[1]。 目前n-3 長鏈脂肪酸得到廣泛的關(guān)注，許多研究表明n-3 長鏈脂肪酸(n-3 LC PUFA)，對健康非常有益，特別是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)對肥胖和肥胖相關(guān)疾病的發(fā)展有預(yù)防作用[3]。 此外，越來越多的證據(jù)表明n-3 LC PUFA 能夠改善肥胖人群的脂肪細胞的代謝和脂肪因子的分泌特征[3]。 脂肪生成是前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程。脂肪分化是一個復(fù)雜的過程，主要由兩個轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控，CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBPs) 和peroxisome proliferator-activated receptorγ(PPARγ)，維持終末脂肪細胞分化的兩種主轉(zhuǎn)錄因子。 它們協(xié)同激活可以表達產(chǎn)生脂肪細胞表型的基因。 此外，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的激活對脂肪的積聚也非常重要。 體內(nèi)研究表明，EPA 和DHA 能減少脂肪積累，增加脂肪基因在大鼠[4]、草魚[5](Ctenopharyngodon idella)脂肪細胞分化中的表達。 此外，一些研究表明DHA 對脂肪細胞分化和前脂肪細胞凋亡的沒有任何作用[1]。 因此，DHA 對脂肪分化因子的作用仍然很矛盾。

脂肪組織主要包含兩種形式，白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)[1]。 WAT 是主要的能量儲存器官，以甘油三酯(triglycerides，TG)的形式積累過剩的能量。 BAT 的作用主要是有產(chǎn)熱功能，BAT 含有豐富的線粒體，線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白 1(uncoupling protein 1，UCP1)含量比較豐富，UCP1能夠運輸質(zhì)子跨過線粒體內(nèi)膜進而破壞氧化磷酸化，這樣就造成了原本用于ATP 合成的能量通過熱能的形式而散失，所以認(rèn)為BAT 對于肥胖的防治起著關(guān)鍵的作用[5]。 其中UCP1 是BAT 產(chǎn)熱的一個重要的標(biāo)記蛋白。 PR 鋅指區(qū)域蛋白16(PR domain containing 16，Prdm16)在細胞命運決定過程中起著重要作用，促進褐色脂肪細胞的發(fā)育。 Prdm16 可以誘導(dǎo)白色脂肪組織細胞的褐色化，Prdm16 通過與PPAR γ 輔助激活物1α(PGC1α)和PPARγ 結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄功能，促進褐色脂肪的發(fā)生[6]。 然而，n-3 LC PUFA 對WAT 和BAT 脂肪分化因子和產(chǎn)熱蛋白影響的證據(jù)還很少。 本研究旨在于探討DHA在肥胖小鼠的WAT 和BAT 中脂肪分化因子的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

32 只雄性SPF 級C57BL/6 小鼠，體重14 ～16 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)在蒙古大學(xué)實驗動物中心【SYXK(蒙)2014-0002】。 在溫度為(23 ±1)℃，光照為12L：12D(Light：Dark，12 h：12 h)的動物房內(nèi)飼養(yǎng)。 動物進行單籠(30 cm × 15 cm × 20 cm)，飼養(yǎng)適應(yīng)1 周。 分別飼以含10% kal 普通對照食物(100 g 食物中含2 g 豬油和2.5 g 大豆油，20 g 蛋白質(zhì)，70 g 碳水化合物，5.5 g 微量元素，Research Diets，Inc。 貨號D12450K)和45% kcal 食物(100 g 食物中含20.68 g 豬油和2.91 g 大豆油，20 g 蛋白質(zhì)，50.91 g 碳水化合物，5.5 g 微量元素，Research Diets，Inc。 貨號D12451)以及45% kcal 加DHA 食物，自由取食和飲水。 所有實驗操作遵循內(nèi)蒙古大學(xué)動物使用相關(guān)倫理要求【YKD2019142】。所有實驗在內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建國家重點實驗室內(nèi)完成。

動物分成4 組：飼喂45% kcl 食物的C57BL/6小鼠(n=8)(C57BL/6H)，飼喂10% kcal 食物的C57BL/6 小鼠(n=8)(C57BL/6C)，飼喂45% kcal加DHA 食物(食物中加藻油，每260 毫克含50 毫克的DHA)(n=8)(FADC)或加DHA 食物(食物中加藻油，每260 毫克含100 毫克的DHA) (n= 8)(FADH)，共飼養(yǎng)20 周，處死動物后取血液、兩側(cè)肩胛間全部的褐色脂肪組織和腹腔內(nèi)所有脂肪。

1.1.2 主要的試劑和儀器

電子天平(賽多利斯公司)離心機(Eppendorf)，代謝儀(FOXBOX，Sable Systems International Inc，Las Vegas，NV，USA)，微量紫外分光光度計(Thermo Scientific Nano Drop 2000c)，PCR 儀(ABI Veriti 96 well Thermal Cycler)，實時定量PCR 儀(ABI7500)。

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(貨號RR047 A，TaKaRa公司，Japan)、RNAase free H2O、RNAiso Plus Total kit(貨號9109，TaKaRa 公司，Japan)。

1.2 方法

1.2.1 體重和攝食

每天8：00 - 9：00 用電子天平稱量動物的體重(精確到0.1 g)。 食物攝入采用食物平衡法測定。實驗開始稱量動物體重，定時、定量放入足夠的飼料塊。 3 d 后于相同時間(上午08：00 - 09：00)稱量食物重量。 食物用電子天平稱重(精確到0.001 g)。 72 h 平均食物攝入=(提供的食物- 剩余食物)/3。

1.2.2 靜止代謝率(resting metabolic rate，RMR)的測定

采用開放式代謝儀進行測定。 在第37 周測定RMR。 小鼠RMR 測定溫度為(30 ± 0.5)℃[熱中性溫度區(qū)(27.5 ～32.5)℃]，動物在測定代謝率前并不禁食，在呼吸室內(nèi)進行代謝率測定期間(約2 h)無飲水和食物的供應(yīng)。 這時測得的代謝率被稱為靜止代謝率(RMR)。 測定時將動物放入呼吸室(1.4 L)[采用生化培養(yǎng)箱控溫在(30 ± 0.5)℃]測定2 h。 測定前后均進行空氣Baseline 測定。 采用公式：

(FR=空氣流速(mL/min)，F(xiàn)i=進入呼吸室之前的空氣含量(%)，F(xiàn)e=從呼吸室流出的空氣含量(%)) ( http：/ /warthog. ucr. edu/WartHogPage/respirometry.html) 計算RMR。 取值時，取30 個連續(xù)穩(wěn)定的最低值的平均值(5 min)作為RMR 的值。 測定前后均稱量動物的體重(電子天平稱量，感量0.1克)。

1.2.3 胰島素、瘦素(Leptin)和甘油三脂(TG)測定

胰島素(貨號10-1132-01，Mercodia 公司，Sweden)、瘦素(貨號ab100718，Abcam，USA)和甘油三脂(TG)(貨號226900，Abcam 公司，USA)用小鼠ELISA 試劑盒進行測定，詳細的操作步驟參照ELISA 試劑盒中的說明書進行。 采用分光光度計讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動換算成樣品血清胰島素、瘦素和甘油三酯的濃度。

1.2.4 熒光定量PCR

RNAiso Plus Total kit(Takara，Japan)提取白色脂肪和褐色脂肪的總RNA，反轉(zhuǎn)合成cDNA，PCR 使用PrimeScript RT Reagent 試劑盒(Takara)擴增引物(見表1)。 定量PCR 擴增在Stratagene 定量PCR 儀(Stratagene，USA) 上進行。 PCR 的反應(yīng)體系為：6.25 μL 2 × SYBR? Premix EX TaqTMmaster mix(Cat. NO. DRR041D，TaKaRa，Japan)，1 μL cDNA 模板和0.2 μmoL/L 引物。 反應(yīng)程序為：95 ℃10 s；95℃5 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，共進行40 個循環(huán)。2-ΔΔCt法檢測RT-PCR 實驗中分析各基因表達的相對差異。 ΔΔCt 值由以下公式得到：ΔΔCt=(Ct靶基因-CtGAPDH)處理組-(Ct靶基因-CtGAPDH)對照組。 靶基因表達水平的變化有下面公式求出：靶基因表達水平差異倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析之前，使用Kolmogorov-Smirnov and Levene tests 檢測數(shù)據(jù)的齊性和正態(tài)分布。 所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。體重和攝食和貯存食物量采用重復(fù)測量(repeated measurement analysis)，顯著差異進一步采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，組間比較采用Turkey HSD 分析。 RMR、脂肪、甘油三酯、胰島素、Leptin、PPARγ、PPARα、CEBPα、SREBP1c、Prdm16、UCP1、PGC1α 采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，組間比較采用Turkey HSD 分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重、食物攝入量和靜止代謝率(RMR)以及甘油三脂(TG)和瘦素(Leptin)的測量

經(jīng)過食物處理后，C57BL/6 H 組的體重比其他3 組小鼠的體重明顯增加(P＜0.01)，而FAD3H 的體重與C57BL/6C 的體重沒有差異。 食物攝取在四組間沒有差異。 C57BL/6 H 組脂肪組織的重量顯著高于其他3 組(P＜0.01)，F(xiàn)AD3 H 組的脂肪重量顯著低于FAD3C 和C57BL/6H，(P＜0.05)，但是與C57BL/6 C 組沒有明顯差異。 這些數(shù)據(jù)表明45%的高脂食物誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠體重和體脂增加，DHA降低高脂食物誘導(dǎo)的C57BL/6 小鼠的體重和體脂的增加。 為了檢測能量消耗，測定了各組的靜止代謝率。 C57BL/6 H 組的靜止代謝率顯著降低，F(xiàn)AD3 H 組的代謝率最高(P＜0.05)(表2)。 這些結(jié)果暗示DHA 可以通過增加FAD3 H 組的靜止代謝率，增加能量支出，從而降低高脂食物誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠的體重和體脂。

肝臟甘油三脂濃度C57BL/6 H 組最高，F(xiàn)AD3H甘油三脂濃度最低(P＜0.05)。 與其他組相比，C57BL/6 H 組的瘦素的含量明顯增多(P＜0.05)，其他三組之間無差異。 (表2)

2.2 白 色 組 織 中 UCP1，PGC1α，PRDM16，PPARα，PPARγ，SREBP1c 和CEBPα mRNA 的表達

在白色組織中，C57BL/6 H 組脂肪分化因子PGC1α、PPARγ、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達明顯高于其他三組(P＜0.05)，暗示C57BL/6 H組體脂的增加可能與相關(guān)脂肪分化因子的表達增高有關(guān)；FAD3 H 組PPARγ、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達明顯低于其他三組(P＜0.05)，說明DHA 可以降低這些脂肪分化因子的mRNA 水平，而線粒體生物合成基因PGC1α 的mRNA 表達顯著低于其他三組(P＜0.05)。 C57BL/6 H 組UCP1 的mRNA 的表達明顯低于其他三組(P＜0.05)，UCP1是產(chǎn)熱的標(biāo)記蛋白，這一結(jié)果暗示其能量支出減少。 FAD3 C 組和FAD3 H 組的UCP1 的mRNA 的表達均明顯高于C57BL/6 C 組和C57BL/6 H 組(P＜0.05)。 FAD3 H 組的Prdm16 顯著高于其他三組(P＜0.05)。 PPARα 的表達4 組無差異。 (圖1)

2.3 褐 色 組 織 中 UCP1，PGC1α，PRDM16，PPARα，PPARγ，SREBP1c 和CEBPα mRNA 的表達

在褐色脂肪組織中，C57BL/6 H 組脂肪分化因子PPARγ 的mRNA 的表達明顯高于其他三組(P＜0.05)；FAD3C 和FAD3H 的PPARγ 的mRNA 的表達低于C37BL6C(P＜0.05)。 再者，F(xiàn)AD3 C 組和FAD3 H 組SREBP1c 的mRNA 表達均明顯高于C57BL/6 C組和C57BL/6 H 組(P＜0.05)；C57BL/6 H 組的SREBP1c 的mRNA 最低。 C57BL/6 H 組的Prdm16的mRNA 顯著高于其他三組(P＜0.05)，F(xiàn)AD3 C 組和FAD3 H 組 的 Prdm16 的 mRNA 明 顯 高 于C57BL/6 C 組，但低于C57BL/6 H 組(P＜0.05)，而FAD3 C 組和FAD3 H 組的Prdm16 的mRNA 沒有差異。 FAD3H 組的PGCLα 的mRNA 表達最高，C57BL/6 H 組和FAD3 C 組的PGC1α 的mRNA 表達高于C57BL/6 C 組，但是低于FAD3 H 組(P＜0.05)。 此外，F(xiàn)AD3 H 組UCP1mRNA 表達明顯高于其他三組(P＜0.05)。 (圖2)

圖1 四組白色脂肪組織中脂肪分化因子和線粒體合成基因的mRNA 的表達Figure 1 mRNA expression of adipose differentiation factor and mitochondrial synthetic gene of white adipose tissue in four groups

圖2 褐色組織中脂肪分化因子和線粒體合成基因的mRNA 的表達Figure 2 mRNA expression of adipose differentiation factor and mitochondrial synthetic gene of brown adipose tissue in four groups

3 討論

DHA 作為n-3 LC PUFA 的主要成分之一，是調(diào)節(jié)細胞信號和基因表達的生物活性化合物的結(jié)構(gòu)成分和前體[1-2]。 許多研究表明，DHA 可能影響脂肪積累。 在本研究發(fā)現(xiàn)通過食物干預(yù)的方法，即飼喂高脂食物和補充DHA 的方法，可降低C57BL/6小鼠高脂食物誘導(dǎo)的體重增加。 研究結(jié)果顯示C57BL/6 小鼠飼喂高脂食物后與體內(nèi)能量積累相關(guān)的指標(biāo)：體重、體脂以及血清甘油三脂和脂肪分泌的瘦素均增加，表明高脂食物誘導(dǎo)了C57BL/6 小鼠的肥胖。 同時，靜止代謝率顯著降低，說明能量支出減少。 然而，C57BL/6 小鼠飼喂高脂食物和DHA 后靜止代謝率明顯增高，暗示C57BL/6 小鼠通過增加能量支出降低體重。 DHA 影響脂肪形成的一個重要方法是調(diào)節(jié)脂肪分化因子的表達。 所以，本實驗研究了DHA 是否通過抑制脂肪分化因子的表達來抑制脂肪積累。

脂肪生成是前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程，脂肪分化因子表達增加，導(dǎo)致白色脂肪的積累。 PPARγ 和SREBP1c 在脂肪沉積中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[1-3]。 本研究結(jié)果表明在白色組織中，C57BL/6 H 組脂肪分化因子PPARγ、PGC1α、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達顯著高于對照組，表明高脂食物誘導(dǎo)脂肪分化因子表達。 與對照組(C57BL/6C)、FAD3 C 組和高脂組(C57BL/6H)相比，F(xiàn)AD3 H 組的PPARγ、PGC1α、SREBP1c 和CEBPα 的mRNA 的表達顯著降低，說明DHA 可以降低脂肪分化因子的表達，從而減少脂肪積累，而且DHA 的作用具有劑量依賴性。 這與在金色中倉鼠中的研究一致[3]，高脂食物飼喂金色中倉鼠后PPARγ 和SREBP1c 表達顯著增加，飼喂高脂食物和n-3 PUFA 后PPARγ 和SREBP1c 表達顯著降低。

褐色脂肪組織和白色脂肪組織的褐色化可以增加能量支出和產(chǎn)熱。 與褐色脂肪相似，白色脂肪中的褐色細胞具有較高的線粒體水平，并表達褐色組織特異性基因，如UCP1 和PGC1α[6-8]。 本研究中飼喂高脂食物和DHA 后，F(xiàn)AD3 C 組和FAD3 H組白色脂肪和褐色脂肪中UCP1 表達比飼喂高脂食物C57BL/6 H 組顯著增加，暗示DHA 可能通過增加白色脂肪組織細胞褐色化和褐色細胞的產(chǎn)熱，增加能量支出，從而降低體重和體脂。 然而，盡管白色脂肪組織中，高脂食物導(dǎo)致PPARγ 和PGC1α mRNA 的表達增加，但是Prdm16 mRNA 沒有任何變化。 但是DHA 卻抑制SREBP1c mRNA 表達，暗示除了PPARγ 和PGC1α 調(diào)節(jié)UCP1 的表達以外，SREBP1c 也可能參與了UCP1 表達的調(diào)節(jié)[9]。 再者，褐色脂肪組織中，高脂食物導(dǎo)致PPARγ 和PGC1α mRNA 的表達增加，但是UCP1 mRNA 表達卻沒有改變，SREBP1c mRNA 表達被降低，進一步證實了本實驗白色脂肪組織中的結(jié)果，暗示SREBP1c 可能在UCP1 表達的調(diào)節(jié)中起重要作用。

總之，本研究結(jié)果表明DHA 可以降低高脂食物誘導(dǎo)的體重增加，通過降低脂肪生成基因PPARγ，CEBPα 和SREBP1c 的表達，增加白色脂肪褐色化基因PGC1α 和UCP1 表達，增加靜止代謝率，從而增加能量支出，降低體重和體脂。