林曉，李健春，譚睿陟，文丹，謝席勝，王麗*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川 瀘州 646000； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000； 3. 南充市中心醫(yī)院腎病科，四川 南充 637000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已超過腎小球腎炎成為終末期腎病的主要病因[1-2]。 目前尚無較理想的治療藥物，積極尋找新的分子靶點(diǎn)尤為重要[2]。 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)作為在多種疾病中出現(xiàn)的新的基因調(diào)控因子和治療靶點(diǎn)備受關(guān)注。 最新研究結(jié)果顯示，腎炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，lncRNA 與糖尿病腎病炎癥反應(yīng)存在密切聯(lián)系[3]。 一些糖尿病腎病中高表達(dá)的lncRNA 能夠促進(jìn)腎的炎癥反應(yīng)和纖維化，加快疾病的發(fā)展進(jìn)程[4-6]。 lncRNA Arid2-IR 是一種最先發(fā)現(xiàn)于UUO 小鼠腎中高表達(dá)的lncRNA，其主要功能為促進(jìn)NF-κB 依賴性腎炎癥，故在治療腎炎癥和纖維化方面具有一定潛力[7]。 目前已有報(bào)道，lncRNA Arid2-IR 在糖尿病腎病中存在高表達(dá)，但關(guān)于Arid2-IR 在糖尿病腎病尤其是糖尿病腎病炎癥方面的研究甚少，其生物學(xué)功能尚未明確[8]。

中醫(yī)藥在腎疾病方面應(yīng)用歷史悠久，黃芪三七合劑為本課題組在臨床上長(zhǎng)期用于治療慢性腎病的復(fù)方制劑，對(duì)腎功能受損有明顯改善作用[9-10]。該方主要由黃芪、三七、昆布、懷牛膝等組成，對(duì)糖尿病腎病也有一定改善作用，但確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本文旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，觀察黃芪三七合劑對(duì)糖尿病小鼠腎炎癥的作用，并通過檢測(cè)黃芪三七合劑對(duì)Arid2-IR/NF-κB 信號(hào)軸的影響，闡明其可能存在的作用機(jī)制，從而為指導(dǎo)臨床用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，雄性，6 ～8 周齡，體重約為18 ～20 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(川)2015-030】，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(川)2018-065】，室溫20 ～22℃，相對(duì)濕度50% ～60%，光照12 h 明暗交替。所有實(shí)驗(yàn)操作均由西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：2019DW017)。

1.1.2 藥物及給藥

黃芪三七合劑主要試劑為黃芪30 g，三七10 g，懷牛膝30 g，當(dāng)歸30 g，昆布30 g 組成，本實(shí)驗(yàn)采用中藥免煎劑，采購(gòu)和制備均由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房完成。 用蒸餾水混勻藥物，最終每毫升藥液含生藥量0.26 g，小鼠每20 g 取0.14 mL 的灌胃量，按1 倍、4 倍劑量等體積每日給低、高劑量組小鼠灌胃。 厄貝沙坦購(gòu)自賽諾菲(杭州)制藥有限公司，配置成等體積混懸液給小鼠灌胃。

1.1.3 試劑與儀器

STZ ( Sigma，S0130 )，Go ScriptTMReverse Transcription System(Promega，A5001)，總RNA 提取試劑盒(北京天根生化科技，DP419)，肌酐測(cè)定試劑盒、尿素氮測(cè)定試劑盒和尿蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，C011-2-1，C013-2-1，C035-2-1)，PAS 染色試劑盒(Solarbio，G 1285)HE染色試劑盒(碧云天試劑有限公司，C0105)，p-NFκB 抗體(Cell Signaling Technology，#3033)，NF-κB抗 體(Cell Signaling Technology，# 8242)，COX2(SantaCruz，sC-376861)，IL-6(Abcam，ab9324)。

LightCycler?480 II 實(shí) 時(shí)熒 光定 量PCR 儀(Thermo Fisher，美國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，凝膠成像儀(Bio-rad，美國(guó))，Nano-Drop2000 Spectrophotometer(Thermo Fisher，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模

C57BL/6 雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成5 組，每組10 只。 正常組(NC)給予普通飼料；模型組(DN)，黃芪三七合劑低劑量組(L-A&P)、高劑量組(H-A&P)，厄貝沙坦(IRB)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)兩個(gè)月后，禁食不禁水12 h 后，連續(xù)5 d 單次腹腔注射劑量為50 mg/kg 體重的STZ(檸檬酸緩沖液配置，pH 4.2 ～4.5)，正常組注射等體積的檸檬酸緩沖液。 1 周后采尾靜脈血測(cè)空腹血糖值，空腹血糖水平高于11.1 mmol/L，則視為糖尿病小鼠造模成功，3 周后收集24 h 尿液，24 h 尿蛋白含量大于30 mg，則視為糖尿病腎病造模成功[11-12]。 黃芪三七合劑低、高劑量組分別給予黃芪三七劑1820 mg/(kg·d)、7280 mg/(kg·d)灌胃，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦20 mg/(kg·d)灌胃，正常組給予等體積生理鹽水，持續(xù)1 個(gè)月。

1.2.2 觀察指標(biāo)及標(biāo)本制備

給藥期間每?jī)芍軠y(cè)定各組小鼠體重，計(jì)算出平均體重；將各組小鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖值。 治療4 周后，處死小鼠，處死之前收集小鼠24 h 尿液。 1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后心臟取血，快速剖取小鼠腎，去包膜，一半凍存于液氮，一半放于4%多聚甲醛固定用于石蠟包埋。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠心臟取血后，將收集的血液4℃過夜，3000 r/min 離心15 min 取上清，按照試劑盒說明書步驟測(cè)定血肌酐，血尿素氮。 收集各組小鼠24 h 尿標(biāo)本，計(jì)算尿量，測(cè)定尿蛋白。

1.2.4 病理染色

按照常方法制備石蠟切片，65℃烤片1.5 h 后梯度脫蠟復(fù)水，HE、PAS 染色嚴(yán)格按照試劑盒說明操作；免疫組化檢測(cè)IL-6、TNF-α 的表達(dá)：石蠟切片脫蠟復(fù)水后，抗原修復(fù)，封閉，一抗4℃過夜，酶標(biāo)二抗37℃孵育1.5 h，上述步驟后均用PBS 洗3 × 5 min 次，DAB 顯色20 s，蘇木素復(fù)染20 s，自來水沖洗，100%乙醇脫水、透明、封片。

1.2.5 Western Blot

采用Western Blot 法檢測(cè)NF-κB 通路相關(guān)指標(biāo)(p-NF-κB/NF-κB，IL-6 和COX2)。 取小鼠腎組織0.025 g 加入裂解液碾碎冰上裂解30 min，離心后取上清用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為40 μg 后加入到10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜后按1 ∶500 的稀釋比例加入多克隆抗體p-NF-κB、NF-κB、IL-6 和COX2 于4℃孵育過夜，后加入HRP 偶聯(lián)二抗常溫孵育1 h。 加入ECL 顯色，凝膠成像分析儀成像，結(jié)果以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參相對(duì)灰度值表示。

1.2.6 Real-time PCR

取小鼠腎組織0.05 g，用總RNA 提取試劑盒提取RNA，Thermo Fisher NANODROP 2000 分光分度計(jì)上檢測(cè)RNA 濃度，按照Go ScriptTMReverse Transcription System(A5001)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。 cDNA 合成反應(yīng)體系為：RNA 2.5 μg，Primer Oligo(dT) 1 μL，Random Primer 1 μL，Nuclease-Free Water 定容到5 μL，混勻離心，70℃5 min，冰浴5 min，離心10 s；之后按照說明書制備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 × Reaction Buffer 4 μL，PCR Nucleotide Mix 1 μL，Go ScriptTMReverse Transcriptase 1 μL，MgCl2(Final concentration 2.5 mM) 1 μL，Nuclease-Free Water 8 μL，輕打混勻。 將cDNA 5 μL 和逆轉(zhuǎn)錄體系15 μL 混合，離心后25℃5 min，4℃1 h，70℃15 min，反應(yīng)完畢加入80 μL Nuclease-Free Water 稀釋樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?LightCycler?480 II 上檢測(cè)Arid2-IR、TNF-α、MCP-1 和IL-1β 的表達(dá)量，引物信息如表1，檢測(cè)到的基因相對(duì)水平用β-actin 正?；?。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的引物序列Table 1 Primer sequences of Real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠體重和空腹血糖的影響

給藥期間，每?jī)芍軠y(cè)定各組小鼠體重和空腹血糖值。 4 周后，與NC 組相比，DN 組的體重和空腹血糖值明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)，黃芪三七合劑治療后，可顯著改善DN 各組小鼠的體重和空腹血糖值，其中尤以A&P 高劑量組和厄貝沙坦組效果最為明顯，差有顯著性(P＜0.01)(圖1)。

圖1 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠體重(A)和空腹血糖(B)的影響Note. Compared with NC group，*P＜0.01. Compared with DN group，#P＜0.05，##P＜0.05.(the same in the following Figures)Figure 1 Effect of Astragalus propinquus Schischkin and Panax notoginseng (A&P)compound on body weight (A) and fasting blood glucose (B) in DN mice

2.2 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠生化指標(biāo)的影響

生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組相比，DN 組能顯著增加24 h 尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮水平(P＜0.01)，A&P 治療后低劑量組僅表現(xiàn)為24 h 尿蛋白的差異具有顯著性(P＜0.05)，A&P 高劑量和厄貝沙坦組則可顯著下調(diào)24 h 尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮表達(dá)，差異具有顯著性(P＜0.01)，表明黃芪三七合劑可有效改善DN 小鼠的腎功能(圖2)。

圖2 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠生化指標(biāo)的影響Figure 2 Effect of Astragalus propinquus Schischkin and Panax notoginseng (A&P)compound on biochemical Indicators in DN mice

2.3 黃芪三七合劑改善DN 小鼠腎病理結(jié)構(gòu)

如圖3 所示，DN 模型組的HE 染色結(jié)果顯示，腎小球肥大，系膜區(qū)基質(zhì)增生明顯，基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞水腫，破裂；PAS 染色結(jié)果顯示，腎小球基質(zhì)明顯增多，糖原空泡和粘液增加。 治療后，腎病理結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，并呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

2.4 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠炎癥指標(biāo)的影響

與正常組相比，DN 模型組IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)量明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)，經(jīng)A&P 治療后，低劑量組對(duì)IL-1β 的影響變化不明顯，差異不具有顯著性(P＞0.05)，A&P 高劑量和厄貝沙坦組均可顯著下調(diào)IL-1β、TNF-α 等炎癥指標(biāo)，差異具有顯著性(P＜0.01)，免疫組化結(jié)果與基因水平的表達(dá)變化一致。 (圖4)

2.5 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠Arid2-IR 和p-NFκB 及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR 結(jié)果顯示，DN 組腎組織Arid2-IR 表達(dá)較NC 組顯著升高(P＜0.01)，治療之后在各組的表達(dá)均明顯下調(diào)，差異具有顯著性(P＜0.05)。 而p-NF-κB、IL-6 及COX2 在DN 腎組織中出現(xiàn)明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)，治療后的上述蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低，其中尤以A&P 高劑量治療組變化最為顯著(P＜0.01)。

圖3 圖3 黃芪三七合劑改善DN 小鼠腎病理結(jié)構(gòu)(×200)Figure 3 Effect of Astragalus propinquus Schischkin and Panax notoginseng (A&P)compound on renal morphology in DN mice(×200)

圖4 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠炎癥指標(biāo)的影響Note. A，PCR results. B，Immunohistochemical results(× 200).Figure 4 Effect of Astragalus propinquus Schischkin and Panax notoginseng (A&P)compound on inflammatory indicators in DN mice

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為糖尿病發(fā)病主要與糖脂代謝異常、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血液微循環(huán)障礙等多種因素有關(guān)。 近年來隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的生物學(xué)功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，因其在人類各種疾病中的普遍存在而受到廣泛關(guān)注。 LncRNA 是一種轉(zhuǎn)錄本大于200 核苷酸、缺乏蛋白編碼能力并在基因組中廣泛轉(zhuǎn)錄的新型非編碼RNA，在遺傳表觀、細(xì)胞分化和細(xì)胞周期調(diào)控等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[13-14]。 最近有研究報(bào)道，高表達(dá)的lncRNA 參與了心血管疾病、癌癥和內(nèi)分泌疾病等的發(fā)生發(fā)展。 尤為重要的是，lncRNA 在糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能提高了糖尿病腎病進(jìn)展為終末期腎病的幾率[4，15]。Yi 等[4]發(fā)現(xiàn)lncRNA Gm4419 敲低改善了糖尿病腎病中NF-κB/NLRP3 炎性體介導(dǎo)的炎癥；Zha 等[6]發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 通過miR-181a/EgR-1/TLR4 軸促進(jìn)糖尿病腎病纖維化和炎癥反應(yīng)；此外，Zhang 等[5]研究報(bào)道lncRNA Rpph1 通過與GaL-3 的相互作用促進(jìn)糖尿病腎病系膜細(xì)胞的炎癥和增殖。 這些lncRNA 的發(fā)現(xiàn)為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)研究提供了新的思路。

圖5 黃芪三七合劑對(duì)DN 小鼠Arid2-IR 和p-NF-κB 及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Notes. A. PCR results of Arid2-IR. B. Western Blot results of p-NF-κB，IL-6 and COX2. C，D，E. Relative content of p-NF-κB，IL-6 and COX2.Figure 5 Effect of Astragalus propinquus Schischkin and Panax notoginseng (A&P)compound on the expression of Arid2-IR，p-NF-κB and related protein in DN mice

lncRNA Arid2-IR 是2015 年首次發(fā)現(xiàn)于UUO小鼠腎進(jìn)展性腎纖維化和炎癥反應(yīng)中高表達(dá)的一種lncRNA。 研究顯示，Smad3 可能通過激活A(yù)rid2-IR-NF-κB 依賴性機(jī)制來調(diào)節(jié)腎的炎癥反應(yīng)[7]；下調(diào)Arid2-IR 表達(dá)可抑制NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)，減緩腎炎癥反應(yīng)[7]提示Arid2-IR 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路可能具有正向調(diào)控作用。 我們?cè)谔悄虿⌒∈竽Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，腎組織中Arid2-IR 表達(dá)顯著上調(diào)，與Yang 等[8]的研究結(jié)果相似。 而在糖尿病腎病發(fā)病進(jìn)程中，由于糖代謝紊亂等多種因素激活NF-κB 信號(hào)通路，激活的NF-κB 易位發(fā)生核轉(zhuǎn)位，調(diào)控多種因子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而產(chǎn)生多種趨化因子和炎性因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，致使通路下游相關(guān)蛋白上調(diào)，IL-1β，IL-6 和TNF-α 等炎癥指標(biāo)表達(dá)升高。 核因子NF-κB 在糖尿病腎病的炎癥機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[16-18]。那么，在糖尿病腎病中l(wèi)ncRNA Arid2-IR 是否通過調(diào)控NF-κB 介導(dǎo)了腎的炎癥反應(yīng)? 為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，隨后我們檢測(cè)了p-NF-κB 及其下游調(diào)控蛋白IL-6 和COX2 和炎癥指標(biāo)IL-1β，IL-6 和TNF-α 的表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)中觀察到糖尿病腎病小鼠“三多一少”癥狀明顯，結(jié)果顯示NF-κB 信號(hào)通路被激活，炎癥反應(yīng)明顯，表明lncRNA Arid2-IR 可能通過激活NF-κB介導(dǎo)了糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)。 提示：Arid2-IR 在腎炎癥中發(fā)揮重要的功能作用，可能作為炎性腎疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”，“水腫”，“尿濁”的范疇，“血瘀”“痰濕”為其主要的病理產(chǎn)物。 其發(fā)病機(jī)制為初期燥熱下消，氣陰兩虛，久而累及腎，致腎體勞衰，精微下泄[19-20]。 中藥治療糖尿病腎病宜標(biāo)本兼顧，滋陰補(bǔ)腎以治本，活血利水以治標(biāo)。 黃芪三七合劑，以益氣補(bǔ)腎、健脾活血的黃芪、三七為君藥，活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)的當(dāng)歸、昆布為臣藥，加上懷牛膝作為使藥，引經(jīng)報(bào)使，引血下行，引藥入腎[21-22]。 該復(fù)方在臨床上用于治療CKD 等效果顯著，且有一定的研究基礎(chǔ)，其機(jī)制可能與改善結(jié)腸機(jī)械屏障功能紊亂和炎癥反應(yīng)，恢復(fù)受損的腎功能，延緩疾病進(jìn)程有關(guān)[9，23]。 那么黃芪三七合劑對(duì)糖尿病腎病的改善作用是否與影響Arid2-IR 有關(guān)?為此我們將黃芪三七合劑進(jìn)一步用于糖尿病腎病小鼠模型，值得注意的是，經(jīng)治療四周后，可觀察到DN 小鼠的體重、空腹血糖值、生化指標(biāo)、炎癥因子的表達(dá)和病理?yè)p傷都得到了明顯改善，同時(shí)lncRNA Arid2-IR 表達(dá)下調(diào)，NF-κB 活性受到抑制，其下游調(diào)控蛋白IL-6 和COX2 均出現(xiàn)下調(diào)，表明黃芪三七合劑可通過下調(diào)lncRNA Arid2-IR 表達(dá)、抑制了Arid2-IR/NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃芪三七合劑可通過調(diào)節(jié)Arid2-IR/NF-κB 信號(hào)軸減輕糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)，從而使糖尿病腎病受損的腎功能得到改善，延緩了疾病病理生理進(jìn)程，這可能是黃芪三七合劑保護(hù)DN 的一個(gè)新機(jī)制。 但黃芪三七合劑通過Arid2-IR/NF-κB信號(hào)軸調(diào)控腎炎癥的具體機(jī)制還需在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證。 我們的結(jié)果為Arid2-IR 作為治療糖尿病腎病的一個(gè)新靶點(diǎn)提供了研究思路，并為指導(dǎo)黃芪三七合劑的臨床應(yīng)用提供了新見解。