趙 艷 吳海濤

（勝利油田中心醫(yī)院 藥學部， 山東 東營257034）

胃癌（gastric cancer，GC） 是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在全球癌癥發(fā)病位居第4 位，病死率第2 位［1］。流行病學統(tǒng)計顯示，我國也是GC 高發(fā)國，大約每3 分鐘就有一名中國人死于胃癌。GC 的發(fā)病機理尚不十分清楚，GC 的治療仍是惡性腫瘤的難題［2］。GC 發(fā)病前為胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC），PLGC 是慢性胃病出現(xiàn)的腸上皮化生及異型增生，其發(fā)展為GC 的概率較高，若能及時阻止PLGC 演進至GC 的惡性過程，就有可能阻止GC 發(fā)生，但目前西醫(yī)仍缺乏有效的治療藥物［3-4］。

中醫(yī)學沒有胃癌前病變的病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸為“痞滿” “癥瘕” “胃脘痛” 等范疇。清代名醫(yī)葉天士在《臨證指南醫(yī)案》 有云“胃痛久而屢發(fā)，必有凝痰聚瘀”?！疤禎帷迸c“瘀血”是胃病共有的病理環(huán)節(jié)，“痰瘀”的形成貫穿于疾病整個過程，不止在GC 發(fā)生之后，而是在PLGC 時就已存在。臨床與動物研究也已證實“痰濁” “瘀血” 與PLGC 的關系緊密［5］?；迪龇绞莿倮吞镏行尼t(yī)院根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，在二陳湯的基礎上化裁獲得的經(jīng)驗方。多年臨床研究也顯示化痰消瘀方在治療胃病變獲得了較好的效果，但其機理尚不明確。研究顯示自噬與許多疾病的發(fā)生密切相關，自噬是細胞程序性死亡方式，自噬與PLGC 及GC 演變過程密切相關，自噬在GC 發(fā)生中具有重大意義［6］。本課題擬考察化痰消瘀方對PLGC 大鼠療效及對自噬相關基因的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wister 大鼠，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（京） 2006-0009。所有大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，期間自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑化痰消瘀處方由陳皮、法半夏20 g，豬苓、莪術、紫丹參和薏苡仁各15 g組成，加入藥材5 倍質量的純凈水，中火煎煮2 次，40 min／次，合并煎液，調整濃度3 g 生藥／mL。藥材陳皮、法半夏、豬苓、莪術、紫丹參和薏苡仁的產地分別為廣東新會、四川成都、貴州貴陽、廣西桂林、云南大理和湖北蘄春，藥材均購于東營百草堂中藥飲片有限公司，由勝利油田中心醫(yī)院藥學部的副主任藥師張麗芝鑒定分別為蕓香科植物橘的成熟果皮、天南星科植物半夏的塊莖、非褶菌目多孔菌科樹花屬藥用真菌、姜科植物莪術的干燥根莖、唇形科紫丹參的干燥根及根莖和禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁。甲硝基亞硝基胍（美國Sigma 公司），臨用前配制，用超純水配制質量濃度為100 μg／mL 溶液，避光保存；胃復春片（杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.36 g／片，國藥準字Z20040003）；DNA 提取試劑盒（美國Promega 公司，貨號A1120）；免疫組織化學染色SP 試劑盒（北京中山生物技術公司，批號30577916）；LC3（貨號ab48394）、Raptor（貨號ab62557）、Beclin-1（貨號ab202319） 一抗均購自英國Abcam 公司；辣根酶標記山羊抗兔二抗（上海博蘊科技有限公司，批號190801）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo 公司，貨號K1622）；BCA 蛋白定量試劑盒（中國碧云天生物技術研究所，批號20190306）；脫氧膽酸鈉（批號201903）、乙 醇（批號201901） 為化學純購自東營市華振化工有限公司，臨用前配置，濃度分別為20 mmol／L 和40%。

1.3 儀器 GeneAmp 9600型PCR 反應擴增儀（美國ABI公司）；NAS-99型紫外分光光度計（美國ACTGene 公司）；Centrifuge5415D型離心機（德 國 Eppdendorf 公 司）；BC-subMIDI型電泳儀（北京六一儀器廠）；BX 50-3E01型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 PLGC 大鼠制備 取SPF 級雄性Wister 大鼠給予含有0.03%雷尼替丁的顆粒飼料；第2 周，每日飲用甲硝基亞硝基胍溶液（避光處理），同時進食2 d 和禁食1 d 的饑飽交替法。進食日上午8：00 至12：00 給予55℃15%氯化鈉溶液（10 mL／kg） 灌胃，下午14：00 至17：00 給予脫氧膽酸鈉溶液（10 mL／kg） 灌胃；禁食日下午14：00 至17：00 給予乙醇（10 mL／kg） 劑量灌胃。灌胃前后1 h 必須禁食禁水，用鉗子鉗住所有制備PLGC 大模型的大鼠尾部，每次30 min，1 次／7 d，使大鼠處于激怒的狀態(tài)，造模持續(xù)6個月。

2.2 分組及給藥 將大鼠隨機分為對照組、模型組、化痰消瘀方低劑量組、化痰消瘀方高劑量組、陽性藥胃復春組，每組15 只。對照組和模型組大鼠每日予生理鹽水（10 mL／kg）灌胃，化痰消瘀方低、高劑量組分別灌胃給予5、10 g 生藥／kg 化痰消瘀方，胃復春組給予0.5 g／kg 胃復春片，連續(xù)給藥4個月。每日記錄大鼠在治療過程的生存狀況和體質量

2.3 HE 染色觀察胃竇部組織病理狀態(tài) 給藥結束后，大鼠禁食不禁水12 h，取胃組織，用生理鹽水洗凈，取胃竇部組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，鏡下觀察病變。

2.4 免疫組化檢測LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達 取各組胃黏膜組織石蠟標本切片，脫蠟，水化，高壓熱修復抗原，3% H2O2氧化15 min，滴加LC3、Raptor、Beclin-1 一抗（1∶50），4℃過夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片。PBS 替代一抗作為陰性對照，免疫組織化學染色陽性為棕褐色或黃色。按強度評分，無色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；染色強度按陽性細胞百分比評分，陰性0 分，陽性細胞≤10% 1 分，11%～50% 2 分，51%～75% 3 分，≥75% 4 分。蛋白表達＝強度×陽性細胞百分比。

2.5 Western blot 檢測胃黏膜組織LC3、Raptor、Beclin-1蛋白表達 取各組胃黏膜組織，加入400 μL RIPA 裂解組織，4℃離心取上清，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白定量為2.0 g／L，煮沸10 min，電泳，轉至PVDF 膜，封閉2 h，漂洗，加入LC3（1∶100）、Raptor（1∶100）、Beclin-1（1∶100）、GAPDH（1∶5 000） 一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌，二抗孵育1 h，TBST 洗滌，加ECL 工作液，顯影，分析，獲得待測蛋白的相對表達。

2.6 RT-PCR 檢測胃黏膜組織LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA表達 按TRIzol RNA 試劑盒說明提取胃組織總RNA，以紫外分光光度計進行定量，取1 μg 總RNA 逆轉錄成cDNA。cDNA 合成體系，焦磷酸二乙酯2 μL，反轉錄緩沖液5 μL，上游和下游引物各1.0 μL，加雙蒸水補至25 μL，37℃反應50 min；將合成的cDNA 置于PCR 反應體系中擴增，反應體系為cDNA 1.0 μL，10×buffer 2.5 μL，Dntp 0.5 μL，Taq 酶1.0 μL，延伸體系2.0 μL，超純水15 μL，上游和下游引物各0.5 μL，加雙蒸水補至23 μL，反應條件96℃預變性1 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)，72℃延伸5 min，以β-actin為內參，計算待測基因的相對表達量。

表1 引物序列

2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.00 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（） 表示，多組間比較采用方差分析；等級資料采用秩和檢驗，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般生存狀況及體質量改變 對照組大鼠色白有光澤，活動敏捷，食量正常，大便呈顆粒狀，尾淡紅色。模型組大鼠毛色黃而無光，活動遲鈍，形體偏瘦，食量少，可見便溏，尾色淡白色?；迪龇降?、高劑量組及胃復春組大鼠的生存狀況介于對照組與模型組之間。如表2 所示，治療前，與對照組比較，其余組大鼠體質量均降低（P＜0.05）。治療后，與對照組比較，模型組大鼠體質量降低（P＜0.05）；與模型組比較，化痰消瘀方組、胃復春組體質量增加（P＜0.05）。

表2 各組大鼠的體質量比較（g， x±s， n＝15）

3.2 大鼠胃組織病理改變 如圖1 所示，對照組大鼠胃黏膜上皮完整，固有膜內的腺體緊密排列且整齊，細胞形態(tài)相同，淋巴細胞少量散在，無明顯的炎癥細胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜腺體萎縮或消失，腺體可見共壁，固有層內可見炎細胞浸潤，浸潤深至黏膜肌層，淋巴細胞聚集于黏膜，血管有增生，腺體紊亂，基底部腺體上皮增生；化痰消瘀方低、高劑量組胃體和胃竇部黏膜炎癥較輕，可見充血、水腫及上皮細胞壞死脫落、淋巴細胞浸潤，少量的嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤；胃復春組胃黏膜上皮較完整，少量散在的淋巴細胞，炎性細胞浸潤黏膜淺層，部分腺體出現(xiàn)萎縮?；迪龇降?、高劑量組和胃復春組的胃組織病理改變介于對照組與模型組之間，腺體排列較整齊，細胞形態(tài)大略相同，炎癥細胞浸潤、充血、水腫及上皮細胞壞死脫落減少。

圖1 大鼠胃組織病理學觀察（×200）

3.3 大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達 如圖2～3、表3 所示，胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 均在細胞核或細胞漿中表達。與對照組比較，模型組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達增高（P＜0.05）；與模型組比較，化痰消瘀方高劑量組、胃復春組胃LC3、Raptor、Beclin-1蛋白表達降低（P＜0.05）；與化痰消瘀方低劑量組比，化痰消瘀方高劑量組胃LC3、Raptor 蛋白表達降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表達 如表4、圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠胃LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表達增高（P＜0.05）；與模型組比，化痰消瘀方組和胃復春組胃LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表達降低（P＜0.05）。

4 討論

化痰消瘀方由陳皮、法半夏、豬苓、莪術、紫丹參和薏苡仁6 味中藥組成，方中陳皮味苦、辛，性溫，歸肺、脾二經(jīng)，可理氣降逆、燥濕化痰、健脾行氣；法半夏味辛，性溫，可化痰降逆、調脾胃升降之氣機，與陳皮聯(lián)用可增強理氣化濕和胃的功效；豬苓利水滲濕；莪術活血行氣、破血消癥；紫丹參活血化瘀、通經(jīng)止痛、瘀滯消除；薏苡仁味甘、淡，性涼，歸脾胃肺經(jīng)，健脾利濕，諸藥共奏健脾理氣及化痰消瘀之功［7-13］。多年的臨床研究顯示，化痰消瘀方具有保護胃黏膜、改善胃黏膜血液循環(huán)、增強黏膜上皮細胞的再生及修復功能，可逆轉慢性萎縮性胃炎，改善腸上皮化生或異型增生。本研究顯示，給予PLGC 大鼠化痰消瘀方連續(xù)4個月，PLGC 大鼠的生存狀態(tài)明顯改善，胃組織炎癥、水腫、上皮細胞壞死脫落和淋巴細胞浸潤等病變均明顯改善，進一步證實了化痰消瘀方對胃病變具有明確的治療效果。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達（×200）

圖3 Western blot 檢測各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達

表3 各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達比較（， n＝15）

表3 各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達比較（， n＝15）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與化痰消瘀方低劑量組比較，△P＜0.05。

表4 各組大鼠胃LC3、 Raptor、 Beclin-1 mRNA 表達比較（， n＝15）

表4 各組大鼠胃LC3、 Raptor、 Beclin-1 mRNA 表達比較（， n＝15）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與化痰消瘀方低劑量組比較，△P＜0.05。

圖4 RT-PCR 檢測各組大鼠胃LC3、Raptor、 Beclin-1 mRNA 表達

細胞自噬作為依賴溶酶體的降解途徑，腫瘤細胞的自噬對于腫瘤細胞的生長具有至關重要的作用，腫瘤細胞因為生長快速而導致腫瘤細胞處于相對缺氧狀態(tài)，腫瘤細胞可通過自噬提供營養(yǎng)及能量，促進腫瘤的持續(xù)生長。LC3是細胞自噬發(fā)生的敏感標志物，LC3 表達可用于評估自噬的活性程度，研究［14-15］報道與非癌或癌旁組織比，胃癌組織中LC3 表達異常升高。PI3K／AKT／mTOR 信號通路對自噬發(fā)揮重要調控作用，Raptor 是該通道的核心分子，參與調控蛋白質合成、代謝、血管生成和自噬等過程，Raptor表達可反映mTOR 的生物學活性。研究表明，Raptor 在早期胃癌組織表達不僅高于正常胃黏膜也高于慢性萎縮性胃炎胃組織，Raptor 在胃癌的表達越高，患者的預后越差，在胃上皮內瘤變階段，Raptor 被激活，細胞開始處于活躍增殖狀態(tài)。Beclin-1 在人類癌癥發(fā)病機制中起關鍵作用，胃癌組織Beclin-1 的高表達提示腫瘤細胞處于活躍生長期［16-18］。本課題結果顯示，與對照組比較，PLGC 模型組大鼠胃組織的LC3、Raptor 和Beclin-1 蛋白及mRNA 表達明顯增高。既往的病理研究認為，當胃部發(fā)生炎性反應時，胃黏膜的腺體呈現(xiàn)萎縮與減少，萎縮的細胞內自噬泡、微囊泡和殘留小體顯著增加，再加上固有腺黏液顆粒擴張，自噬泡容易被機械擠壓到胞膜下直至與細胞膜融合，因此細胞膜的LC3、Raptor 和Beclin-1 表達增高，一定程度反映了胃病變的程度［19］。給予化痰消瘀方后，PLGC 大鼠胃組織的LC3、Raptor 和Beclin-1 蛋白及mRNA 均明顯降低，提示化痰消瘀方有助于抑制PLGC 的自噬。相關的文獻報道，化痰消瘀方中的組成或成分對LC3、Raptor 和Beclin-1 相關的自噬具有一定的抑制作用，如黃小波等［20］分離培養(yǎng)HUVEC細胞，考察陳皮-半夏對Beclin-1 和LC-3 等自噬通路的調節(jié)作用，結果顯示陳皮-半夏可能通過抑制HUVEC 細胞中Beclin-1 和LC-3 的表達，而發(fā)揮提高內皮細胞存活率，治療動脈粥樣硬化的作用。唐丹麗等［21-22］研究顯示，與空白對照組比較，含有半夏的栝蔞薤白半夏湯組可降低心肌細胞的Beclin-1 和LC-3 表達，從而抑制自噬而起到心肌保護作用。白曄等［23］體外研究顯示，采用石油醚提取含有半夏和茯苓的化痰消食方可通過下調LC3 表達而拮抗內皮細胞的自噬性死亡。

綜上所述，PLGC 存在明顯的細胞自噬，化痰消瘀方可用于治療PLGC，其可能機理在于降低胃LC3、Raptor 和Beclin-1 自噬相關蛋白及mRNA 表達。