史桂榮 任博文 杜旭召 張啟威 史棟梁*

（1.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 商丘476100； 2.河南省中醫(yī)院骨病一科， 河南 鄭州450002）

中醫(yī)藥在中國和亞洲其他國家已經(jīng)使用了數(shù)千年，可用于各種疾病的防治且副作用很小。雞屎藤Paederia scandens（Lour.） Merr 是一種茜草科植物，主要分布于我國的長江中下游及以南各省。雞屎藤在中國、日本、韓國等地有著悠久的藥用歷史，廣泛用于緩解疼痛、炎癥等癥狀。研究表明，環(huán)烯醚萜及其相關(guān)的環(huán)烯醚萜苷化合物（雞屎藤苷、車葉草苷、雞屎藤苷酸等） 是雞屎藤主要的藥理活性成分［1］。

骨關(guān)節(jié)炎（OA） 是滑膜關(guān)節(jié)的一種漸進(jìn)性疾病，在許多老年人中導(dǎo)致進(jìn)行性疼痛，但除了止痛藥物和物理治療外，目前還沒有特別有效的治療OA 的藥物，這些藥物的療效有限。隨著對OA 病理的日益清楚的了解，迫切需要獲得一種有效的內(nèi)源性修復(fù)藥物，減緩OA 的進(jìn)程。本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)探討雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（CH8 細(xì)胞） 購自中國科學(xué)研究院。

1.2 藥物與試劑 雞屎藤苷酸（paederosidic acid，PA，批號B20585，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；DMEM／F12 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco 公司）；MTT 溶液（美國Sigma 公司）；ELISA 試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；PrimeScript RT reagent 試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司］；兔抗MMP-3、MMP-13、p-p65、p65、p-IκBα、IκBα 抗體（美國Cell signaling 公司）；IgG-辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的羊抗兔二抗（美國Invitrogen 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（CH8 細(xì)胞） 接種于含10%胎牛血清的DMEM／F12 培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，進(jìn)行傳代，取第2 代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 軟骨細(xì)胞炎癥造模 取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%融合時(shí)，加入含IL-1β（10 ng／mL） 的DMEM／F12培養(yǎng)液處理CH8 細(xì)胞24 h［2］。

2.3 MTT 檢測CH8 細(xì)胞增殖 將CH8 細(xì)胞以1×104／孔的濃度接種于96 孔板，加入10、20、40、80、150 μg／mL 雞屎藤苷酸處理24 h；對照組只含DMEM／F12 培養(yǎng)液，加入MTT 溶液（5 mg／mL） 37℃孵育4 h，隨后在室溫條件下與二甲基亞砜共同孵育10 min，在酶標(biāo)儀上測定其在570 nm處的吸光度值（OD）。加入含IL-1β（10 ng／mL） 的DMEM／F12 培養(yǎng)液處理CH8 細(xì)胞24 h，加入10、20、40、80、150 μg／mL 雞屎藤苷酸處理24 h，按上述MTT 方法，測定在570 nm 處的吸光度值（OD）。

2.4 ELISA 檢測NO 水平 將CH8 細(xì)胞以1×105／孔的濃度接種于6 孔板，加入含IL-1β（10 ng／mL） 的DMEM／F12培養(yǎng)液處理CH8 細(xì)胞24 h，加入10、20、40、80 μg／mL雞屎藤苷酸處理24 h，收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用ELISA 試劑盒，按說明書測定培養(yǎng)基中NO 的水平。

2.5 RT-PCR 檢 測 CH8 細(xì) 胞MMP-3、MMP-13、iNOsmRNA 表達(dá) 收集細(xì)胞，用TRIzol 試劑提取總RNA，用PrimeScript RT reagent 試劑盒將1μg 總RNA 逆轉(zhuǎn) 錄成cDNA。參照SYBR Green PCR Master Mix 構(gòu)建20 μL 反應(yīng)體系，于ABI Prism 7500 序列檢測系統(tǒng)上進(jìn)行反應(yīng)檢測。引物序列，MMP-3 正向5′-GGAGATGCTCACTTTGACGATG-3′，反向5′-CAGCAACCA GGAATAGGTTGG-3′；MMP-13正 向 5′-GGTCCCAAAC GAACTTAACTTACA-3′，反 向 5′-CCTTGAACGTCATCATCAGGAAGC-3′ ；iNOs正 向5′-CCTCAAGCTATCGAATTTGTC-3′，反 向 15′-TTGCCATTGTT GGTGGAGTA-3′；β-actin正向5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，反向5′-CTCATAGCTCTTCTCCAGGGAGGA-3′。

2.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，用冷凍PBS 洗滌2 次后加入裂解緩沖液進(jìn)行超聲處理，4℃、10 000 r／min離心10 min 收集上清液。BCA 蛋白試劑盒測定細(xì)胞上清液的蛋白質(zhì)濃度。取30 μg 蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。用5% 脫脂乳于常溫下封閉1 h，加入抗體MMP-3、MMP-13、p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、β-actin，4℃孵育過夜。用TBST 洗滌后，加入IgG-辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL） 檢測免疫反應(yīng)，以β-actin 為內(nèi)參作對照。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞增殖的影響 單獨(dú)處理CH8 細(xì)胞24 h，不同濃度雞屎藤苷酸（10、20、40、80、150 μg／mL） 促進(jìn)CH8 細(xì)胞增殖（P＜0.05），無細(xì)胞毒性。與對照組比較，IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞24 h，CH8 細(xì)胞增殖抑制（P＜0.05），而雞屎藤苷酸干預(yù)24 h，其能促進(jìn)CH8 細(xì)胞增殖。見圖1。

圖1 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞增殖的影響

3.2 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)的影響 如圖2 所示，與對照組比較，IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞上調(diào)MMP-3、MMP-13 蛋白及mRNA 表達(dá)（P＜0.05），而雞屎藤苷酸干預(yù)后，抑制MMP-3、MMP-13 蛋白及mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。

圖2 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞MMP-3、MMP-13 蛋白表達(dá)的影響

3.3 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞NO 水平、iNOsmRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較，IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞產(chǎn)生NO，增加iNOSmRNA 表達(dá)（P＜0.05），而雞屎藤苷酸則能抑制IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞產(chǎn)生NO，降低iNOsmRNA表達(dá)（P＜0.05）。見圖3。

3.4 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞p-p65、p-IκBα 蛋白表達(dá)的影響 NF-κB 是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞iNOS 降解的重要調(diào)節(jié)因子。與對照組比較，IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞促進(jìn)p-p65、p-IκBα 表達(dá)（P＜0.05），而雞屎藤苷酸能抑制IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞p-p65、p-IκBα 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見圖4。

4 討論

圖3 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞NO 水平、 iNOs mRNA 表達(dá)的影響

圖4 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞p-p65、p-IκBα 蛋白表達(dá)的影響

雞屎藤苷酸是從雞屎藤中分離得到的一種有效成分，具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗胃癌等藥理作用［3-5］。然而，雞屎藤苷酸在骨關(guān)節(jié)炎的作用迄今尚未見報(bào)道。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與老齡化、負(fù)重過大等過程有關(guān)，進(jìn)而引發(fā)一系列的分子事件，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞死亡和結(jié)構(gòu)損傷，尤其是炎癥反應(yīng)。大量研究表明，IL-1β 與OA 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且在顳下頜關(guān)節(jié)炎［6］、手骨關(guān)節(jié)炎［7］和膝關(guān)節(jié)炎［8］滑膜液中IL-1β 水平顯著升高。OA 的發(fā)生發(fā)展與軟骨細(xì)胞促炎細(xì)胞因子（IL-1β） 的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此，本研究用IL-1β（10 ng／mL） 誘導(dǎo)人軟骨CH8 細(xì)胞炎性損傷，以模擬OA 的體外模型，研究雞屎藤苷酸在骨關(guān)節(jié)炎的作用。發(fā)現(xiàn)雞屎藤苷酸可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，并下調(diào)MMP-3 和MMP-13表達(dá)，以及NO 和iNOs 表達(dá)。此外，雞屎藤苷酸抑制IL-1β 激活的NF-κB 信號通路。

雖然對軟骨損傷的分子生物學(xué)進(jìn)行了廣泛的研究，但至今還沒有發(fā)現(xiàn)某個(gè)單一因素會(huì)導(dǎo)致軟骨損傷［9］。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程中，滑膜釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，軟骨細(xì)胞活化后產(chǎn)生MMPs 和NO，這些分子進(jìn)一步引起軟骨結(jié)構(gòu)改變［10］。骨關(guān)節(jié)炎的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 大分子降解，軟骨細(xì)胞蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致關(guān)節(jié)嚴(yán)重疼痛，運(yùn)動(dòng)能力喪失，進(jìn)行性不可逆功能障礙，而MMPs 被認(rèn)為是降解ECM 的關(guān)鍵分子。MMP-3 可通過激活各種MMPs 前體，如pro-MMP-1、pro-MMP-7、pro-MMP-8、pro-MMP-13，以及裂解細(xì)胞外成分等加重炎癥反應(yīng)［11］。MMP-13 可降解骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中的細(xì)胞外基質(zhì)［12］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)雞屎藤苷酸明顯降低MMP-3 和MMP-13 的蛋白表達(dá)，提示雞屎藤苷酸可能通過下調(diào)MMP-3 和MMP-13 的表達(dá)，來調(diào)控IL-1β 處理的軟骨細(xì)胞ECM 的降解。

在促炎因子中，NO 是一種具有快速和自發(fā)反應(yīng)（與超氧陰離子反應(yīng)） 的主要毒性物質(zhì)，通過這種反應(yīng)生成過氧亞硝酸和過氧亞硝酸陰離子。目前已鑒定出3 種形式的NOS，其中iNOS 除了被合成用于對炎癥刺激的反應(yīng)外，還能誘導(dǎo)高水平的NO 生成［13］。NO 是OA 發(fā)病過程中重要的炎癥介質(zhì)，前期的研究［14］發(fā)現(xiàn)iNOS 在IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞可導(dǎo)致NO 的過度產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，雞屎藤苷酸抑制IL-1β 刺激人軟骨細(xì)胞NO 的產(chǎn)生和iNOS 的表達(dá)，表明雞屎藤苷酸在IL-1β 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞抑制NO 的產(chǎn)生和iNOS 的表達(dá)。

炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ECM 降解的重要因素。多種炎癥因子可觸發(fā)IκBα 的磷酸化和降解，并將NF-κB 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，促進(jìn)炎癥蛋白合成和促炎分子（IL-6、TNF-α） 釋放，導(dǎo)致軟骨變性［14-15］。在非刺激條件下，NF-κB 二聚體與抑制蛋白IκB 結(jié)合后以非活性形式存在于胞漿中。在各種化學(xué)和機(jī)械信號刺激下，NF-κB 蛋白被活化，進(jìn)而通過IκB 激酶使IκB 發(fā)生磷酸化［16］。在OA 中，軟骨細(xì)胞表達(dá)多種NF-κB介導(dǎo)的分解性細(xì)胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 受體激活因子（RANKL）、IL-8 等，這些因子和趨化因子促進(jìn)MMPs 的產(chǎn)生，抑制膠原和蛋白多糖的合成，并在一個(gè)正反饋回路中增強(qiáng)NF-κB 的活化［17］。蔡林奕等［18］研究表明，NF-κB 抑制劑bay11-7082 可顯著降低經(jīng)TNF-α 處理的軟骨細(xì)胞中MMPs 的表達(dá)。此外，Liacini等［19］研究還表明在人軟骨細(xì)胞中，NF-κB 抑制劑可抑制IL-1β誘導(dǎo)的MMP-3 和MMP-13 的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)雞屎藤苷酸可抑制IL-1β 誘導(dǎo)CH8 細(xì)胞p-p65、p-IκBα 蛋白表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，雞屎藤苷酸通過抑制人軟骨細(xì)胞MAPK 和NF-κB 信號通路，抑制IL-1β 誘導(dǎo)的NO 產(chǎn)生，以及MMP-3、MMP-13、iNOS 的表達(dá)。雞屎藤苷酸可能是進(jìn)一步開發(fā)抗關(guān)節(jié)炎藥物的理想候選藥物。