趙拴平， 徐 磊， 金 海， 李 默， 賈玉堂

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031)

我國(guó)是世界肉牛養(yǎng)殖大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)，依據(jù)地理分布，我國(guó)黃牛分為中原黃牛、北方黃牛和南方黃牛三大類[1]。大別山牛是中原黃牛的典型代表，主要分布于安徽省的太湖、岳西、桐城、潛山、金寨、宿松等縣和湖北省大別山西部的湖北、河南部分地市。大別山牛長(zhǎng)期以來作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要?jiǎng)恿?，形成了耐粗飼、抗病力?qiáng)、肉質(zhì)細(xì)膩、善爬坡的優(yōu)良特點(diǎn)，但也同時(shí)具有個(gè)體小、生長(zhǎng)慢等不足。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開展大別山牛體尺性狀的選育具有重要意義。

胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)基因是最早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性印跡基因，能夠促進(jìn)有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育以及參與腫瘤細(xì)胞增殖過程等[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Thomsen等研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因座位于豬2號(hào)染色體短臂末端，是影響肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積的關(guān)鍵QTL[4]，韓瑞華等研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因SNPs位點(diǎn)g.120C>T和g.279A>G與秦川牛胴體性狀(宰前活重、胴體重、胴體長(zhǎng)、胴體胸深、眼肌面積)顯著相關(guān)(P<0.05)，與肉質(zhì)性狀(大理石花紋、嫩度、pH24)顯著相關(guān)(P<0.05)，與背部皮下脂肪厚極顯著相關(guān)(P<0.01)[5]；黃永震等研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)及其單倍型與秦川牛體高、體長(zhǎng)、胸寬、胸深和體重顯著相關(guān)(P<0.05)[6]，與郟縣紅牛18～24月齡體重顯著相關(guān)(P<0.05)[7]，說明IGF2基因?qū)εＩL(zhǎng)性狀具有重要影響，為此，本研究采用PCR和測(cè)序技術(shù)探究IGF2基因SNPs位點(diǎn)與大別山牛群體體尺性狀的相關(guān)性，以期為我國(guó)大別山牛生長(zhǎng)性狀的遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系合肥綜合試驗(yàn)站試驗(yàn)基地安徽省阜陽(yáng)市潁上縣牛哥牧業(yè)科技有限公司和國(guó)家肉牛核心育種場(chǎng)安慶市太湖縣久鴻農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限責(zé)任公司隨機(jī)選取238頭健康、無親緣關(guān)系的大別山母牛(24～48月齡)，試驗(yàn)牛生長(zhǎng)環(huán)境和飼喂日糧無顯著差異。

1.2 樣品采集及體尺指標(biāo)測(cè)定

采集試驗(yàn)牛黃豆大小的耳組織，放入加有75%乙醇的離心管中，冷藏于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。采樣同時(shí)測(cè)量試驗(yàn)牛的體斜長(zhǎng)、體高、十字部高、胸圍、腹圍、管圍、腰角寬、坐骨端寬等體尺數(shù)據(jù)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛IGF2基因(NC_037356.1)為模板，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-TCTCTCTCCCGCAGACATCA-3′，下游引物為5′-CACACCCCCAGTGACTTTTA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 IGF2基因多態(tài)性檢測(cè)

利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP304)進(jìn)行牛組織樣基因組提取，將提取好的DNA統(tǒng)一稀釋到100 ng/μL冷藏備用。

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2*Taq Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)充至25.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，32個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃總延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)基因型分析結(jié)果，計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、遺傳雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，利用SPSS 23.0軟件分析SNPs位點(diǎn)的基因型與大別山牛生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

GLM模型：Yijk=μ+Ai+Gj+Eijk

式中：Yijk指第ijk個(gè)個(gè)體的性狀；μ指群體總體平均值；Ai指年齡效應(yīng)；Gj指遺傳效應(yīng)；Eijk指隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF2基因PCR產(chǎn)物檢測(cè)

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)顯示牛IGF2基因(NC_037356.1)定位于29號(hào)染色體，包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，其cDNA序列包含540 bp開放閱讀框，編碼179個(gè)氨基酸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，特異性較好，片段大小與預(yù)期一致。

注：M為DNA Marker；1～8為PCR產(chǎn)物。

圖1 大別山牛IGF2基因第一內(nèi)含子的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 IGF2基因SNPs位點(diǎn)分析

通過PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，IGF2基因第一內(nèi)含子區(qū)存在3個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為g.22218G>A、g.22421C>T和g.22448G>T，g.22218G>A位點(diǎn)有GG、GA和AA 3種基因型，g.22421C>T位點(diǎn)有CC、CT和TT 3種基因型，g.22448G>T位點(diǎn)有GG、GT和TT 3種基因型(圖2)。

圖2 大別山牛IGF2基因SNPs位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

2.3 IGF2基因SNPs位點(diǎn)遺傳參數(shù)分析

大別山牛IGF2基因SNPs位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率見表1。在g.22218G>A位點(diǎn)，等位基因G屬于優(yōu)勢(shì)等位基因，基因型GG為優(yōu)勢(shì)基因型；在g.22421C>T位點(diǎn)，等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因型CT為優(yōu)勢(shì)基因型；在g.22448G>T位點(diǎn)，等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因型GT為優(yōu)勢(shì)基因型?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)SNPs位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，遺傳指數(shù)(基因純合度(Ho)、基因雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)如表1中所示，3個(gè)位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)(0.25

表1 大別山牛IGF2基因SNPs位點(diǎn)遺傳參數(shù)分析

2.4 IGF2基因SNPs位點(diǎn)基因型對(duì)大別山牛生長(zhǎng)性狀的影響

利用SPSS 23.0軟件分析IGF2基因第一內(nèi)含子SNPs位點(diǎn)與大別山牛群體生長(zhǎng)性狀相關(guān)性結(jié)果如表2所示：g.22218G>A位點(diǎn)GG基因型和GA基因型個(gè)體的體斜長(zhǎng)和胸圍顯著優(yōu)于AA基因型個(gè)體(P<0.05)，GG基因型和GA基因型個(gè)體的腹圍極顯著優(yōu)于AA基因型個(gè)體(P<0.01)；g.22421C>T位點(diǎn)CT基因型個(gè)體的體高和腰角寬顯著優(yōu)于CC基因型個(gè)體(P<0.05)，腹圍極顯著優(yōu)于CC基因型個(gè)體(P<0.01)； g.22448G>T位點(diǎn)GT基因型個(gè)體的胸圍顯著優(yōu)于GG和TT基因型個(gè)體(P<0.05)，GT基因型個(gè)體的腹圍和腰角寬極顯著優(yōu)于GG和TT基因型個(gè)體(P<0.01)。

表2 牛IGF2基因第一內(nèi)含子SNPs位點(diǎn)與大別山牛體尺性狀的相關(guān)性分析

注：同一SNPs位點(diǎn)同列數(shù)據(jù)后標(biāo)小寫字母a，b表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)大寫字母A、B表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

研究利用PCR和測(cè)序技術(shù)尋找IGF2基因第一內(nèi)含子的多態(tài)位點(diǎn), 分析了3個(gè)SNPs位點(diǎn)不同基因型在大別山牛群體間的分布規(guī)律，為以后分子遺傳標(biāo)記的進(jìn)一步確定進(jìn)而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇提供基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因第一內(nèi)含子區(qū)存在3個(gè)SNPs位點(diǎn)(g.22218G>A、g.22421C>T和g.22448G>T)，且每個(gè)SNPs位點(diǎn)均有3種基因型，基因內(nèi)含子區(qū)的SNPs位點(diǎn)雖然不參與轉(zhuǎn)錄過程，但大量研究發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的增強(qiáng)子或抑制子進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄效率，通過調(diào)節(jié)核小體位置控制DNA結(jié)合而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程[8-9]，因此，本研究發(fā)現(xiàn)的SNPs位點(diǎn)可以通過作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子間接參與轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)揮其生物學(xué)作用。

多態(tài)信息含量(PIC)和雜合度(He)是度量群體內(nèi)遺傳變異的標(biāo)記，數(shù)值越高，說明遺傳變異越大，選擇潛力越大。大別山牛群體IGF2基因第一內(nèi)含子區(qū)的3個(gè)SNPs位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)(0.25

4 結(jié) 論

IGF2基因第一內(nèi)含子區(qū)3個(gè)SNPs位點(diǎn)均與大別山牛部分體尺性狀具有顯著或極顯著相關(guān)性，提示其可作為大別山牛分子標(biāo)記輔助選擇的有效DNA分子標(biāo)記。