藍 睿，劉應華，蘇云順，王馨嫻，趙 謙，尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2.姚安縣動物疫病預防控制中心，云南姚安 6753002；3.楚雄州動物疫病預防控制中心，云南 楚雄 675000)

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起豬的一種病毒性疾病，具有傳染性高和傳播范圍廣的特征，嚴重時發(fā)病劇烈、高燒不退甚至伴有全身敗血性癥狀，世界各地都有流行，是國際獸疫局要求必須上報的疾病之一，也是豬病中危害性最大且重視程度最高的動物傳染性疾病之一[1]。

CSFV只有一個血清型。根據(jù)5’非編碼區(qū)、E2基因和NS5B聚合酶基因的序列數(shù)據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，CSFV分為三種基因型：1型、2型和3型，每種基因型進一步分為3個或4個基因亞型。其中CSFV基因亞型2.1在國內(nèi)外流行最廣，并被進一步分為CSFV基因亞型2.1a、CSFV基因亞型2.1b和CSFV基因亞型2.1c[2]。CSFV的四種基因亞型(1.1、2.1、2.2和2.3)在我國廣泛流行，其中CSFV基因亞型2.1b在過去10年中逐漸成為我國主要的流行毒株。本研究通過調(diào)查云南省CSFV流行株E2基因的遺傳變異，分析云南省部分地區(qū)CSFV流行毒株與疫苗毒株的突變情況，為豬瘟防治提供合理科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及疫苗

本試驗樣品為2018年云南省各地區(qū)豬場200份疑似豬瘟的送檢樣品，通過RT-RCR得到4個來自楚雄州某豬場、紅河州某豬場和曲靖市某豬場病豬的淋巴結(jié)、腎臟和脾臟等陽性樣品；新溫必沙豬瘟活疫苗購自吉林和元生物工程股份有限公司。

1.2 試驗試劑

RNAiso Plus、DL2000 Marker和EcoR I限制酶購自寶生物工程(大連)有限公司；Easy First-Strand cDNA SuperMix和2×TransTag HIFI Mix II(-dye)購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖購自白賽勤化學技術有限公司；pClone007 Vector Kit和TreliefTM5α Chemically Competent Cell購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司。

1.3 引物來源

擴增CSFV E2全基因引物參照文獻獲取和合成[3]，引物信息如表1所示。

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1.4 CSFV E2全基因擴增

按照RNAiso Plus試劑盒說明書處理樣品和提取核酸。將提取的RNA按照2×ES Reaction Mix 5 μL、EasyscriptTMRT/RI Emzyme Mix 0.5 μL、 下 游 引 物1 μL和模板RNA 3.5 μL的反應體系以及42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的反應程序進行反轉(zhuǎn)錄。CSFV E2基因PCR擴增反應體系為：2×Trans HiFiII 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL和cDNA 1.0 μL，反應體系為25 μL。擴增程序為94 ℃ 5 min、94 ℃30 s、60 ℃ 40 s和72 ℃ 40 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 CFSV E2全基因分子克隆

將1.3.2中擴增的PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pClone007載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞TrelieTM5α中，連接轉(zhuǎn)化具體操作步驟按照pClone007 Vector Kit和TreliefTM5α Chemically Competent Cell試劑盒說明書進行。搖菌后按照試劑盒操作說明書提取重組質(zhì)粒。

1.6 質(zhì)粒酶切鑒定及測序

37 ℃水浴鍋中用EcoR I限制酶單酶切質(zhì)粒1 h～3 h，接著用1.5%瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進行電泳鑒定(酶切位點信息如表2所示)，最后將鑒定正確的質(zhì)粒送去測序。酶切體系：EcoR I限制酶1 μL、10× 緩沖液 2 μL、DEPC 16 μL、質(zhì)粒1 μL，總反應體系20 μL。

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1.7 基因同源性比較和遺傳進化樹分析

利用Megalign軟件比較本試驗獲取的流行毒株與GeneBank基因庫中參考毒株E2全基因序列的同源性，建立遺傳進化樹對遺傳關系進行分析，參考毒株序列信息如表3所示。

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2 結(jié)果

2.1 CFSV E2全基因PCR擴增

利用CFSV E2基因引物擴增云南省4個地區(qū)病豬的CFSV陽性組織樣品，PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，得到與預期片段大小(1 343 bp)相符的條帶(圖1)。

2.2 CSFV E2全基因目的片段的純化

PCR擴增目的基因并通過1%瓊脂糖凝膠電泳富集PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示目的片段大小為1 343 bp，與預期結(jié)果相符(圖2)。根據(jù)膠回收試劑盒操作說明進行目的片段回收，回收產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，目的片段大小與預期結(jié)果相符(圖3)。

2.3 CSFV E2目的片段酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒用EcoR I限制酶進行單酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切結(jié)果出現(xiàn)1 408 bp和1 846 bp兩個片段，其中目的片段約為1 408 bp，與預期相符，見圖4。

2.4 CSFV E2全基因序列同源性分析

本次試驗將云南省不同地區(qū)獲得的4株CSFV云南流行毒株分別命名為YN-QJ、YN-HH、YN-HH2和YN-CX，疫苗毒株命名為YM-2，具體信息見表4。用DNA Star 6.0中Editseq、Seqman以及Megalign離線軟件對4株CSFV流行毒株的E2基因序列、1株疫苗毒株序列和17株參考序列進行比對分析，可知同源性為81.8%～99.6%，表明E2基因同源性存在較大差異，4株CSFV流行毒株間的基因同源性為81.7%～99.6%，與疫苗毒株同源性為81.3%～94.5%，見圖5。

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2.5 CSFV E2基因遺傳進化分析

為進一步分析CSFV云南地方流行毒株與CSFV國內(nèi)外分離株基因組之間的親緣關系，用GenBank中獲取的17株CSFV國內(nèi)外參考毒株與4株CSFV云南地方流行毒株的E2基因序列構建基因遺傳進化樹，結(jié)果顯示本試驗獲得的4株CSFV云南流行毒株和疫苗毒株屬于1亞群和2亞群，主要分布在2.1分支和1.1分支上，而2.1亞型主要以2.1c為主。流行毒株YN-HH、YNHH2和YN-CX分布在CSFV的2.1c基因亞型分支上，而毒株YN-QJ和疫苗毒株YM-2的親緣關系較近，均分布于CSFV的1.1基因亞型，并未發(fā)現(xiàn)CSFV的其他基因型或基因亞型(2.2亞型、2.3亞型和基因3型)的毒株，遺傳進化樹見圖6。

3 討論

E2基因是CSFV基因組中最容易發(fā)生變異的區(qū)域，使CSFV更能適應環(huán)境的變化。這種變異性直觀地反映了CSFV流行毒株關鍵抗原表位的變異，這也是導致疫苗接種失效的原因之一。該基因的2 508～2 697位核苷酸序列(190 bp)是公認用于分析CSFV的遺傳變異的片段之一，具有最好的鑒別能力和最高的置信度，它能區(qū)分核苷酸差異很小的毒株。因此，該片段普遍用于CSFV的多樣性分析。E2基因的分析結(jié)果不僅可反映毒株的遺傳關系，還關聯(lián)著毒株間的免疫關系。此外，CSFV的中和性抗原表位都位于gp55囊膜糖蛋白上，該蛋白可以誘導機體產(chǎn)生保護反應，參與病毒感染細胞的過程，因此E2基因在CSFV分子流行病學研究中備受重視。

20世紀40年代分離到的石門毒株與70～80年代分離到的HeNZZ1/82毒株以及90年代分離到的BJCY1/96、BJTX3/96和GDGZ1/95毒株的E2基因同源性高達99.1%，說明E2基因的高變區(qū)在某種程度上呈現(xiàn)一定的穩(wěn)定性；20世紀90年代分離到的3株毒株HeBHH1/95株、HeNXH2/98株和GHBH1/98株與豬瘟兔化弱毒C株的核苷酸的同源性均為100%，這表明CSFV流行株的E2變異呈現(xiàn)一定的多樣性，向遠離疫苗株的方向發(fā)生變異[4]。2006—2007年遼寧省CSFV流行毒株已經(jīng)從基因1型向基因2型轉(zhuǎn)變，與CSFV的石門毒株和兔化弱毒株在基因序列間存在較大的差異，也在向遠離疫苗毒株的方向現(xiàn)發(fā)生變化[5]。本試驗通過RT-PCR和分子克隆及測序，獲得了4株CSFV云南流行毒株和1株CSFV疫苗毒株的E2基因核苷酸序列，基因全長均為1 119 bp。將獲取的4株CSFV流行毒株與國內(nèi)外不同分型的18株CSFV參考序列進行基因同源性比較和構建基因遺傳進化樹分析。結(jié)果顯示，4株CSFV云南流行毒株間的核苷酸同源性為81.7%～99.6%；CSFV疫苗毒株與CSFV流行毒株的核苷酸同源性為81.3%～94.5%，其中3株CSFV流行毒株與CSFV疫苗毒株的同源性相對較低，表明云南省CSFV流行毒株在基因上產(chǎn)生了不同的遺傳變異?；蜻z傳進化樹分析顯示，4株CSFV云南流行毒株中僅有1株CSFV流行毒株和CSFV疫苗毒株在一個分支上，屬于1.1基因亞型。其他3株CSFV流行毒株分布在另外一個進化分支上，屬于2.1c基因亞型，進一步表明在云南流行的CSFV流行毒株在遺傳上出現(xiàn)了進化的差異。云南省不同地區(qū)當前部分流行的CSFV呈現(xiàn)遺傳變異多樣性，這與國內(nèi)其他區(qū)域研究CSFV的變化趨勢一致[6-7]。因此，有必要長期在云南省開展CSFV的分子流行病學調(diào)查，為豬瘟的防控提供理論和技術參考。