劉 鑫，余 盈，何 蔚

(贛南醫(yī)學院 1.2017級碩士研究生；2.2014級碩士研究生；3.藥理學教研室；4.江西省腦血管藥理重點實驗室；5.心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，是老年人群癡呆的最常見類型，其主要臨床表現是進行性記憶和認知障礙、判斷力和日常生活自理能力下降，嚴重的患者甚至產生行為失常精神神經癥狀。AD的主要神經病理性特征有β淀粉樣蛋白(beta-amyloid，Aβ)沉積老年斑形成、神經元內纖維纏結、神經元丟失和突觸丟失等[1-2]。AD的發(fā)病與年齡相關，隨著老齡化進程的加劇，AD的發(fā)病率逐年升高，已成為嚴重危害老年人健康的主要疾病之一。

歐前胡素(imperatorin)是傘形科中藥蛇床子、白芷、羌活的有效成分之一，是一種呋喃香豆素[3-5]。歐前胡素具有抗炎、抗氧化、抗焦慮、抗驚厥、舒張血管平滑肌、抗血栓形成和阻滯鈣通道等作用[5-8]。研究證實，歐前胡素對東莨菪堿和脂多糖誘導的學習記憶障礙有明顯的改善作用[8-9]。本課題組前期研究顯示，歐前胡素有神經保護作用，歐前胡素有抗腦缺血損傷的作用，另外，歐前胡素還有抗癡呆作用，在跳臺實驗中，歐前胡素對Aβ1-42致AD癡呆模型小鼠的被動回避性學習記憶障礙有明顯的改善作用，歐前胡素可減輕Aβ1-42致小鼠AD后腦組織氧化應激反應，抑制活性氧自由基的產生和抑制脂質過氧化反應及增強機體的抗氧化能力[10-11]。由于Aβ沉積及其觸發(fā)的炎癥反應在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，本課題利用Aβ1-42誘導小鼠AD模型，采用八臂迷宮評估歐前胡素對小鼠空間學習記憶障礙的影響，檢測歐前胡素對大腦皮層和海馬中炎癥因子TNF-α和IL-1β產生及p-p38和p-ERK蛋白表達的影響，觀察歐前胡素對AD模型小鼠空間辨別學習記憶障礙的改善作用以及對大腦皮層和海馬組織中炎癥反應的抑制作用，進一步揭示歐前胡素防治AD的作用機制，為把歐前胡素開發(fā)用于防治AD提供理論依據。

1 材料及方法

1.1實驗動物SPF級BALB/c小鼠，♂，體重20～25 g，贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供，生產許可證SCXK(贛)2014-0001。動物實驗過程中嚴格遵守中華人民共和國科學技術部《關于善待實驗動物的指導性意見》(國科發(fā)財字﹝2006﹞398號)的相關規(guī)定，嚴格遵守美國NIH發(fā)布的實驗動物的保護和使用指南(NIH 出版 No. 85-23, 1996修訂)，并嚴格遵守用最少的動物數量完成實驗并盡量減少實驗動物痛苦的原則。

1.2藥品和試劑歐前胡素(純度>99.5 %，購自中國食品藥品鑒定研究院，批號110826-201214)，用二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司產品)溶解，吐溫-80(Tween 80，美國Sigma公司產品)助溶后用生理鹽水稀釋至所需濃度，溶媒對照液為含12.5% DMSO + 2% Tween 80的生理鹽水；Aβ1-42(美國sigma公司產品)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(美國R&D 公司產品)，p-p38、p38、p-ERK、ERK一抗抗體(美國Cell Signaling Technology公司產品)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗抗體(美國Cell Signaling Technology公司產品)，BCA 蛋白檢測試劑盒(美國Pierce公司產品)，ETC化學發(fā)光液(美國Pierce公司產品)，Marker蛋白(美國Pierce公司產品)，PVDF膜(美國Millipore公司產品)，其它試劑為市售分析純。

1.3主要儀器RMT-100八臂迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，Bio-Rad電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，Thermo Varioskan Flash全波長讀數儀(美國thermo公司)，TS-1000型脫色搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，多用途旋轉搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，CR22GⅢ高速冷凍離心機(日本日立公司)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)。

1.4方法

1.4.1小鼠AD模型的建立將Aβ1-42溶于滅菌注射用水中，密封后置37 ℃培養(yǎng)箱內孵育72 h。將小鼠用10%水合氯醛(350 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉后，腦室內注射參照文獻[12]進行定位，用10 μL微量注射器在小鼠腦室內(Bregma點后0.5 mm，中線旁開1.0 mm，深度2.5 mm)緩慢注射410 pmol (3.0 μL)凝聚態(tài)Aβ1-42，1 min注完，注射完后停留3 min再拔針。正常對照組小鼠腦室內注射等體積滅菌注射用水。

1.4.2實驗動物分組及給藥雄性BALB/c小鼠48只，隨機分為4組，分別為正常對照組、AD模型組、AD模型+歐前胡素2.5 mg·kg-1和AD模型+歐前胡素5.0 mg·kg-1組，每組12只。AD模型+歐前胡素用藥組動物在手術當天開始腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥13 d，正常對照組和AD模型組在相同時間點腹腔注射溶媒10 mL·kg-1。

1.4.3八臂迷宮實驗小鼠腹腔注射給藥連續(xù)13 d后，進行八臂迷宮實驗評估各組小鼠的學習記憶功能，記錄小鼠的工作記憶錯誤次數(working memory errors，WME，即在同一次測試中小鼠再次進入已吃過食粒的臂的次數)、 參考記憶錯誤次數(reference memory errors，RME，即在同一次測試中小鼠進入未放置食粒的臂的次數)和總錯誤次數(total errors，TE)。迷宮實驗結束后將動物麻醉后斷頭取腦，分離出大腦皮層和海馬組織并分裝于冷凍管中，液氮中保存，用于各觀察指標測定。

1.4.4小鼠大腦皮層和海馬組織中炎癥因子的測定按照試劑盒說明書配置勻漿介質處理大腦皮層和海馬組織樣本，嚴格按照說明書的操作步驟，用ELISA檢測小鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α和IL-1β含量，蛋白定量采用BCA法。

1.4.5 WesternBlot檢測蛋白表達每組分別隨機取4只小鼠的部分大腦皮層和海馬組織，利用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法蛋白定量，實驗各組取等量蛋白質進行電泳，再轉膜至PVDF膜；將轉膜好的PVDF膜放置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫下反應1 h；封閉后加一抗抗體ERK(1∶1 000)、p-ERK(1∶2 000)、p38(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；再加用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗溶液(1∶5 000)，室溫下反應2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min；化學發(fā)光法檢測，掃描灰度值用Image J進行測定分析。

2 結 果

2.1歐前胡素對AD小鼠空間學習記憶障礙的影響八臂迷宮實驗顯示，正常對照組、AD模型組、歐前胡素2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1給藥組這4組小鼠在工作記憶錯誤次數、 參考記憶錯誤次數和總錯誤次數三個指標上差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。通過LSD檢驗顯示，與正常對照組比較，AD模型組小鼠的工作記憶錯誤次數、 參考記憶錯誤次數和總錯誤次數較多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與AD模型組比較，歐前胡素2.5 mg·kg-1給藥組和5.0 mg·kg-1給藥組小鼠的工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數和總的錯誤次數均較少，差異均有統(tǒng)計學意義(對于2.5 mg·kg-1給藥組P均<0.05，對于5.0 mg·kg-1給藥組P均<0.01)(圖1)。說明歐前胡素可以改善AD模型小鼠的空間學習記憶障礙。

圖1 歐前胡素對AD小鼠空間學習記憶障礙的影響

注：Control：正常對照組，Model：AD模型組，IMP-L：歐前胡素 2.5 mg·kg-1組，IMP-H：歐前胡素5.0 mg·kg-1組；WME：工作記憶錯誤次數，RME：參考記憶錯誤次數，TE：總錯誤次數。與正常對照組比較##P<0.01；與AD模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2歐前胡素對小鼠大腦皮層和海馬中TNF-α和IL-1β的含量的影響ELISA結果顯示，正常對照組、AD模型組、歐前胡素2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1給藥組這4組小鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α和IL-1β含量存在組間差異(P均<0.01)。通過LSD檢驗顯示，與正常對照組相比，AD模型組大腦皮層和海馬兩個部位中 TNF-α和IL-1β的含量均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)；與AD模型組比較，歐前胡素兩個給藥組的TNF-α和IL-1β含量均較低，差異有統(tǒng)計學意義(對于2.5 mg·kg-1組P均<0.05，對于5.0 mg·kg-1組P均<0.01)，如圖2所示，說明歐前胡素可抑制Aβ1-42致小鼠AD后TNF-α和IL-1β的產生。

圖2 歐前胡素對小鼠大腦皮層和海馬中 TNF-α和IL-1β的含量的影響

注：Control：正常對照組，Model：AD模型組，IMP-L：歐前胡素 2.5 mg·kg-1組，IMP-H：歐前胡素5.0 mg·kg-1組。與正常對照組比較##P<0.01；與AD模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.3歐前胡素對p-p38、p38、p-ERK和ERK蛋白表達的影響無論是大腦皮層還是海馬組織中，4組小鼠p-p38/p38和p-ERK/ERK這兩個指標均有差異(P均<0.01)。通過LSD檢驗，AD模型組小鼠同正常對照組相比，大腦皮層和海馬中p-p38/p38和p-ERK/ERK的比值均更高(P均<0.01)；與AD模型組比較，歐前胡素2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1兩個給藥組p-p38/p38和p-ERK/ERK的比值均更低(對于2.5 mg·kg-1組P均<0.05，對于5.0 mg·kg-1組P均<0.01)(圖3)。

圖3 歐前胡素對p-p38、p38、p-ERK和ERK蛋白表達的影響

注：Control：正常對照組，Model：AD模型組，IMP-L：歐前胡素 2.5 mg·kg-1組，IMP-H：歐前胡素5.0 mg·kg-1組。與正常對照組比較##P<0.01；與AD模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

我們前期利用腦室內注射Aβ1-42誘導小鼠AD模型，采用跳臺法觀察了歐前胡素能改善小鼠被動回避反應學習記憶障礙。本實驗采用八臂迷宮實驗進一步觀察歐前胡素對空間學習記憶障礙的影響，研究顯示，歐前胡素能減少迷宮實驗工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數和總的錯誤次數，說明歐前胡素可以改善AD模型小鼠的空間學習記憶障礙。

大量研究證實，β淀粉樣蛋白沉積老年斑和神經元內纖維纏結是AD的重要神經病理性特征，炎癥反應在AD的病理生理變化中起著重要作用[13-14]。TNF-α和IL-1β是介導AD發(fā)病及病理變化的重要炎癥介質，在AD患者和AD動物模型的腦中都已觀察到TNF-α和IL-1β明顯升高，抑制TNF-α和IL-1β產生及炎癥反應，可防止和減慢AD的發(fā)病及進展[15-16]。我們的結果顯示，腦室內注射Aβ1-42誘導小鼠AD后，大腦皮層和海馬組織中TNF-α和IL-1β的含量升高，歐前胡素給藥組TNF-α和IL-1β含量低于AD模型組，說明歐前胡素可抑制Aβ1-42致小鼠AD后炎癥因子TNF-α和IL-1β的產生。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的重要信號轉導系統(tǒng)，此通路可調節(jié)細胞的生長、分化、凋亡和死亡等多種生理過程。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、細胞外調節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和ERK5是哺乳類細胞中MAPK信號通路的主要亞族。大量研究證實，p38和ERK激活在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，抑制p38和ERK的激活有減輕炎癥反應和抗AD的作用[17-19]。我們實驗結果顯示，Aβ1-42誘導小鼠AD后可導致大腦皮層和海馬中p-p38和p-ERK蛋白表達增加，而歐前胡素治療組p-p38和p-ERK蛋白的表達比模型組降低，歐前胡素可抑制p38和ERK 的激活。

綜上所述，歐前胡素具有改善AD癡呆模型小鼠空間學習記憶障礙的作用，歐前胡素可抑制大腦皮層和海馬組織中炎癥反應。結合我們的前期研究發(fā)現，歐前胡素可減輕AD癡呆模型小鼠腦組織氧化應激反應，抑制活性氧自由基和脂質過氧化物的產生，增強機體的抗氧化能力，對AD小鼠的被動回避性學習記憶障礙具有改善作用。我們的研究結果提示，歐前胡素有防治AD的作用，其作用機制部分可能通過抑制氧化應激損傷和炎癥反應有關。我們將進一步揭示歐前胡素防治AD的作用機制，為把歐前胡素開發(fā)用于防治AD提供理論依據。