王 斐，謝 璐，沈鎮(zhèn)平，劉雨霞，劉志平

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2017級(jí)碩士研究生; 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.2015級(jí)生物技術(shù)本科生；4.炎癥與免疫中心，江西 贛州 341000)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel diseases, IBDs)，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是一種以慢性腸道炎癥為特征的疾病[1]。IBD在發(fā)達(dá)國家比較常見，近20年來，在中國的發(fā)病率也呈持續(xù)上升的狀態(tài)[2]。由于IBD發(fā)病機(jī)制不清楚，復(fù)發(fā)率高，極大影響患者及其家屬的生活質(zhì)量[3]，因此研究IBD的發(fā)病機(jī)制迫在眉睫[4]。

干擾素調(diào)節(jié)因子家族(Interferon regulatory factors, IRFs)是共同含有一個(gè)保守的N端DNA結(jié)合域(DBD)和一個(gè)IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域(IAD)的轉(zhuǎn)錄因子家族[5]，在哺乳動(dòng)物中由9個(gè)成員組成：IRF1-IRF9。IRFs參與機(jī)體細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、宿主防御、病毒潛伏和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)[6]。其中IRF3和IRF7在I型IFN介導(dǎo)的先天免疫中起著關(guān)鍵作用[7]。IRF3和IRF7是異源二聚體，但這兩個(gè)因子在很多方面發(fā)揮著不同的作用。IRF3組成性表達(dá)在多種類型的細(xì)胞中，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)感染早期Ⅰ型IFN-β轉(zhuǎn)錄[8]。IRF7主要存在于B細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)和單核細(xì)胞中，低表達(dá)在其他大多數(shù)細(xì)胞中，且需要IFN-α激活進(jìn)而再誘導(dǎo)更多的IFN-α[9]。

研究顯示，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中IRF3、IRF7基因表達(dá)量升高；IRF3-/-小鼠對(duì)葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的易感性增加[10]。這提示IRF3缺失可能與IBD的發(fā)生相關(guān)。但I(xiàn)RF3/7與IBD之間的關(guān)系尚不明確。為進(jìn)一步確定IRF3/7-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的易感性，并探討IRF7是否與IFR3通過相同的信號(hào)通路在結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中起作用，本研究利用DSS飼喂IRF3/7-/-小鼠構(gòu)建結(jié)腸炎模型，探討IRF3/7在結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物WT使用購于南京模式動(dòng)物研究所的C57BL/6小鼠，IRF3/7-/-小鼠由中科院昆明動(dòng)物所齊曉朋研究員提供，均飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2試劑DSS購自美國MP Biomedicals公司；Sybergreen 試劑盒購自美國賽默飛；TSLP-ELISA試劑盒、IL-33-ELISA試劑盒均購自武漢博世德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠生存率由致炎劑DSS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生結(jié)腸炎，實(shí)驗(yàn)組為IRF3/7-/-小鼠，對(duì)照組為WT小鼠，第0天在飲用水加入3%DSS，5天后撤DSS，換正常飲用水繼續(xù)喂養(yǎng)。記錄各組小鼠在0～10天的生存率。

1.2.2小鼠結(jié)腸炎模型造模方法第0天將小鼠的飲用水加入2%的DSS，喂5天后撤DSS，換正常飲用水繼續(xù)喂養(yǎng)。記錄各組小鼠在第0、3、5、6、7、8天的體重。并分別在0、3、5、8天這4個(gè)結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展最典型的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠測(cè)量結(jié)腸長度、稱量脾臟重量并采集結(jié)腸組織。

1.2.3 PCR測(cè)定目標(biāo)基因表達(dá)在特定時(shí)間收集腸道樣品，使用Trizol 分離RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 然后通過目標(biāo)基因如細(xì)胞因子的特定引物，使用 Sybergreen 試劑盒檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1及TLSP、IL-33的基因表達(dá)情況。見表1。

表1 引物序列

1.2.4 ELISA測(cè)定目標(biāo)蛋白表達(dá)對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行勻漿，14 000 rpm 離心，取上清。按ELISA試劑盒方法，使用樣品稀釋液對(duì)結(jié)腸提取蛋白樣品進(jìn)行稀釋，加樣，37 ℃孵育，加入酶標(biāo)抗體孵育后加入底物液顯色，最后加入終止液，于450 nm處測(cè)定OD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。生存率用Log-rank檢驗(yàn)。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1IRF3/7-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)腸炎高度易感我們首先檢測(cè)WT和IRF3/7-/-小鼠在較高濃度的DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的生存率。發(fā)現(xiàn)在3% DSS喂養(yǎng)條件下，在DSS喂養(yǎng)5天后IRF3/7-/-小鼠有明顯的致死現(xiàn)象，表現(xiàn)為便血嚴(yán)重，體重急速下降。到第8天時(shí)IRF3/7-/-小鼠開始出現(xiàn)死亡，到第10天死亡60%，而WT小鼠在這個(gè)濃度DSS中全部存活(圖1A)。之后我們將DSS的濃度調(diào)整為2%，重新建立結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)IRF3/7-/-小鼠在DSS撤藥后雖然不死亡，但體重下降較WT嚴(yán)重(圖1B)，并且小鼠呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)。在不同時(shí)間點(diǎn)收集小鼠的結(jié)腸組織，測(cè)量長度發(fā)現(xiàn)IRF3/7-/-小鼠隨著炎癥越嚴(yán)重，結(jié)腸的長度縮短的程度越高，在第5天和第8天與WT小鼠相比有很明顯差異(圖1C)。同時(shí)脾臟重量結(jié)果顯示IRF3/7-/-小鼠在DSS處理第5天比WT小鼠脾臟更大，進(jìn)一步支持IRF3/7-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)腸炎更易感(圖1D)。

圖1 IRF3/7-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)腸炎高度易感

A：3% DSS喂養(yǎng)后各組小鼠生存率；WT和IRF3/7-/-, 每組n=5。B：2% DSS喂養(yǎng)后各組小鼠的體重變化；WT和IRF3/7-/-, 每組n=6。C：2% DSS喂養(yǎng)后各組小鼠的結(jié)腸長度；WT和IRF3/7-/-, 每組n=5～7。D：2% DSS喂養(yǎng)后各組小鼠的脾重情況WT和IRF3/7-/-, 每組n=5～7。注：*P<0.05; ****P<0.0001。

2.2炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)量測(cè)定我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)收集小鼠結(jié)腸組織，使用qPCR檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況。IL-6和TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是IBD中相關(guān)的主要促炎介質(zhì)[11]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α基因表達(dá)在結(jié)腸炎中呈上調(diào)趨勢(shì)，并且IRF3/7-/-小鼠的TNF-α的表達(dá)量在第8天比WT小鼠顯著升高(圖2 A，B)。我們也檢測(cè)了其他炎癥細(xì)胞因子IL-β和MCP-1的表達(dá)，在DSS處理后第5天，也是結(jié)腸炎出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)，IRF3/7-/-小鼠結(jié)腸中IL-1β和MCP-1的表達(dá)量顯著性高于WT小鼠(圖2 C, D)。

圖2 IRF3/7-/-小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)

A：2% DSS處理后各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)腸組織中IL-6的表達(dá)量。B：TNF-α基因的表達(dá)量。C：IL-1β基因的表達(dá)量。D：MCP-1基因的表達(dá)量。注：WT和IRF3/7-/-, 每組n=4～8；*P<0.05，**P<0.01。

2.3IRF3/7-/-小鼠TSLP和IL-33的表達(dá)量在結(jié)腸炎癥階段明顯更高TSLP和IL-33都是已知對(duì)結(jié)腸有保護(hù)作用的細(xì)胞因子，在結(jié)腸炎癥恢復(fù)期起很重要的作用。IRF3-/-小鼠在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的炎癥和恢復(fù)期，伴有TSLP和IL-33生成的缺陷[10]。本次研究的實(shí)驗(yàn)組為IRF3/7-/-小鼠，通過結(jié)腸組織提取RNA檢測(cè)TSLP的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，IRF3/7-/-小鼠炎癥時(shí)期(第5天)結(jié)腸組織中TSLP基因相對(duì)與同期WT小鼠不但沒有缺陷，而且有著更高趨勢(shì)的表達(dá)水平(圖3A)。IL-33結(jié)果顯示IRF3/7-/-小鼠炎癥時(shí)期(第5天)結(jié)腸組織中IL-33基因相對(duì)與同期WT小鼠也沒有缺陷，并且有顯著性上調(diào)(圖3B)。為了進(jìn)一步確認(rèn)，我們利用ELISA檢測(cè)TSLP和IL-33的蛋白表達(dá)。與qPCR的結(jié)果一致，在結(jié)腸炎癥時(shí)期IRF3/7-/-小鼠的TSLP和IL-33的表達(dá)沒有缺陷，在第8天IL-33比WT還更高(圖3C，3D)。這提示IRF3/7在結(jié)腸炎所介導(dǎo)的作用不依賴于TSLP和IL-33, 這一點(diǎn)可能與IRF3的作用機(jī)制不同。

圖3 IRF3/7-/-小鼠結(jié)腸TSLP、IL-33基因和蛋白的表達(dá)

A：不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸中TSLP的基因表達(dá)情況(PCR法)。B： 不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸中IL-33的基因表達(dá)情況(PCR法)。C：不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸中TSLP蛋白表達(dá)情況(ELISA法)。D：不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸中IL-33蛋白表達(dá)情況(ELISA法)。注：WT和IRF3/7-/-, 每組n=4～8；*P<0.05, ***P<0.001。

3 討 論

盡管IBD的發(fā)生機(jī)制至今未明，但DSS因其誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎具有潰瘍性結(jié)腸炎中炎癥和潰瘍的典型組織學(xué)特征而被廣泛應(yīng)用于結(jié)腸炎動(dòng)物模型[12]。本研究利用DSS建立的小鼠結(jié)腸炎模型，探討IRF3、IRF7與結(jié)腸炎的關(guān)系。結(jié)果顯示，IRF3/7-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎十分易感，表現(xiàn)在比WT小鼠有更高的死亡率，且結(jié)腸長度縮短更為嚴(yán)重。結(jié)腸組織勻漿中TNF-α、IL-6、TSLP和IL-33在炎癥刺激第5天和第8天的基因表達(dá)和蛋白含量較WT組明顯升高。

IRF3和 IRF7都是調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的重要轉(zhuǎn)錄因子,能夠控制Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)的產(chǎn)生[13]。但是，IRF3和IRF7調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的機(jī)制可能不同，有研究表明IRF3具有有限的DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性，而IRF7具有更廣泛的DNA結(jié)合特異性，有助于其刺激延遲型IFN基因表達(dá)[14]。IRF3在細(xì)胞組成性表達(dá)，是病毒感染早期反應(yīng)的重要組成部分[15-16]，IRF3的過度表達(dá)顯著增強(qiáng)了病毒介導(dǎo)的IFN-α/β基因的表達(dá)[17]。IRF7不在細(xì)胞中組成性表達(dá)，而是由IFN、LPS或者病毒感染誘導(dǎo)表達(dá)[18]。且文獻(xiàn)表明，IRF7在TLR7/9/MyD88信號(hào)通路中起調(diào)控作用[19]。如果IRF7缺失，IFN-α的產(chǎn)生嚴(yán)重受損，而MyD88缺失IFN-α的產(chǎn)生并不受影響，提示IRF7在誘導(dǎo)Ⅰ型IFN-α的通路中起重要作用[20]。前期研究表明在IRF3-/-小鼠結(jié)腸炎的炎癥期和恢復(fù)期，伴有TSLP和IL-33生成的缺陷[10]。但在本次研究中發(fā)現(xiàn)IRF3/7-/-小鼠結(jié)腸組織中TSLP和IL-33的基因表達(dá)和蛋白含量較WT組明顯升高，趨勢(shì)與IRF3-/-小鼠不一致，提示在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中IRF3和IRF7的作用機(jī)制和所介導(dǎo)的信號(hào)通路可能不同，也即是IRF7可能介導(dǎo)特異的信號(hào)通路。

綜上所述，IRF3/7-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有更為易感的趨勢(shì)，并且在結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中IRF3/7-/-小鼠在腸道炎癥細(xì)胞因子比WT小鼠明顯上調(diào)。說明IRF3/7對(duì)結(jié)腸炎均有保護(hù)作用。但是，與IRF3-/-小鼠不同，IRF3/7-/-小鼠在腸道TSLP和IL-33的表達(dá)無明顯缺陷，提示IRF7與IRF3在結(jié)腸炎中的作用機(jī)制可能不一樣。研究IRF7和IRF3在機(jī)體抵抗結(jié)腸炎中的不同作用有利于我們了解IBD發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制。