薛綺雯

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；上海伯豪生物技術(shù)有限公司，上海 201203）

外周神經(jīng)損傷后經(jīng)常會導(dǎo)致神經(jīng)源性痛，這種疼痛的性質(zhì)為痛覺過敏[1]。外周神經(jīng)損傷動物模型代表了神經(jīng)源性痛的一種動物模型。研究表明，外周神經(jīng)損傷可以引起背根節(jié)神經(jīng)元中的神經(jīng)肽、受體、離子通道和神經(jīng)營養(yǎng)因子長時程的基因表達的變化。這些基因的表達改變可能與神經(jīng)性痛的產(chǎn)生和維持有關(guān)。

常用的外周神經(jīng)損傷動物模型包括：坐骨神經(jīng)軸索切斷模型[2]、坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型（CCI）[3]、坐骨神經(jīng)部分損傷模型（PSL）[4]、脊神經(jīng)選擇結(jié)扎模型（SNL）[5]和坐骨神經(jīng)分支選擇損傷模型（SNI）[6]。后4種模型的模式圖見圖1。

ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成員包括mRNA、lncRNA、circRNA和假基因。在一些轉(zhuǎn)錄本之間，成員間擁有共同的miRNA應(yīng)答元件MREs，通過競爭性結(jié)合miRNA，互為ceRNA，從而相互調(diào)節(jié)彼此功能[8]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

MicroCL 17R 離心機，Thermo Fisher；GENE VORTEX-2 振蕩器，Scientific Industries；NanoDrop ND-2000 紫外分光光度計，Thermo Fisher；Agilent 2100 生物芯片分析系統(tǒng)，Agilent；G5761A 型 Agilent Technologies SureScan Dx Microarray Scanne，Agilent；G2534A 型不銹鋼雜交芯片架，Agilent；G2534-60013型芯片墊片，Agilent；G2545A型雜交恒溫箱，Agilent；HB-100型加熱模塊，杭州博日科技有限公司；9700型 GeneAmp PCR 儀，Applied Biosystems

圖1 神經(jīng)病理性疼痛的動物模型和模型檢測方法[7]

1.2 主要試劑

TEIzol Reagent（ACS，Invirtogen，美國）；氯仿（AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國）；異丙醇（AR，上海實驗試劑有限公司，中國）；無水乙醇（AR，Sigma-Aldrich，美國）；RNeasy mini Kit (250)（ACS，QIAGEN，德國）；單標(biāo)低起始量快速擴增標(biāo)記試劑盒（ACS，Agilent，美國）；單標(biāo)RNA插入試劑盒（ACS，Agilent，美國）；基因表達雜交試劑盒（ACS，Agilent，美國）；基因表達洗滌試劑盒（ACS，Agilent，美國）；含RNase抑制劑的高效cDNA逆轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（ACS，Applied Biosystems，美 國 )；Power SYBR Green PCR Master Mix（ACS，Applied Biosystems，美國）；無核糖酶水（ACS，Ambion，美國）

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立與取材

采用Decosterd和Woolf建立的SNI外周神經(jīng)損傷疼痛模型。取2個月大的SLAC C57小鼠經(jīng)復(fù)合麻藥（甲芐噻嗪 10 mg/kg，氯胺酮 95 mg/kg，乙酰丙嗪0.7 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剃毛消毒，沿脛骨切開皮膚，鈍性分離股二頭肌暴露出坐骨神經(jīng)及其末端腓腸神經(jīng)、腓總神經(jīng)和脛骨神經(jīng)三支分支（圖2）[6]。用玻璃分針找到腓總神經(jīng)和脛骨神經(jīng)，用10-0的醫(yī)用絲線將腓總神經(jīng)和脛骨神經(jīng)緊緊結(jié)扎，在結(jié)扎遠端將其切斷并將遠端的神經(jīng)根切去2～4 mm，保持完整的腓腸神經(jīng)，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚，消毒后放至溫暖處等待小鼠蘇醒。手術(shù)過程中注意避免對腓腸神經(jīng)有接觸和牽拉?？刂平M操作過程同上，但不結(jié)扎和剪斷神經(jīng)。分別在手術(shù)后6h、2d、7d、14 d和28 d，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后用20 mL生理鹽水心臟灌流，取L4-6背根神經(jīng)節(jié)（DRG）。TRIzol法提取總RNA，實驗設(shè)3次重復(fù)。

圖2 坐骨神經(jīng)分支選擇損傷模型示意圖

1.3.2 總RNA的提取與純化

每 100 mg組織加入 1 mL TRIzol試劑，并用均漿器勻漿。加入200 μL的氯仿，震蕩混勻1 min，靜置5 min，離心 15 min。小心取出上清液，避免觸及中間層，將上清液推入新的1.5 mL離心管，加入600 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置 5 min，離心 15 min。吸去上清，保留沉淀，并向沉淀中加入600μL 70%乙醇，離心10 min，洗滌沉淀。吸去上清，沉淀室溫自然晾干后加入適量無核糖酶水，用移液器槍頭吹吸，并充分溶解沉淀。用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計測定RNA含量，并用Agilent 2100生物分析儀電泳質(zhì)檢合格后取7 μg總RNA使用RNeasy mini Kit進行純化。純化后再次用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計測定RNA濃度。樣本于-20 ℃保存。

1.3.3 ceRNA芯片實驗

1.3.3.1 RNA的放大和標(biāo)記

實驗樣品RNA采用單標(biāo)低起始量快速擴增標(biāo)記試劑盒和標(biāo)準操作流程對樣品總RNA進行放大和標(biāo)記，并用 RNeasy mini kit純化標(biāo)記后的 cRNA。

1.3.3.2 芯片雜交

按照Agilent表達譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準流程和配套的基因表達雜交試劑盒，在65 ℃、10 r/min滾動雜交爐中滾動雜交17 h，雜交cRNA上樣量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用試劑為基因表達洗滌試劑盒。

1.3.3.3 芯片掃描

完成雜交的芯片采用安捷倫微陣列掃描儀進行掃描，軟件設(shè)置染料通道：綠色，掃描分辨率為3 μm，光電倍增管（PMT）100%，20 bit。用特征提取軟件 10.7（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）讀取數(shù)據(jù)，最后采用R軟件中l(wèi)imma包進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.3.4 生物統(tǒng)計學(xué)方法構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)

首先通過ceRNA機制分析挖掘功能circRNA，將circRNA和mRNA做差異并集，進行miRNA預(yù)測。分析方法：circRNA和mRNA表達正相關(guān)，且結(jié)合相同的miRNA。結(jié)合預(yù)測方法：circRNA-miRNA預(yù)測采用targetscan和miRanda兩個數(shù)據(jù)交集取前10；miRNA-mRNA預(yù)測為targetscan結(jié)果。構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，然后與 mRNA 的 IPA（Ingenuity Pathway Analysi，一款數(shù)據(jù)分析軟件）結(jié)果進行關(guān)聯(lián)。通過數(shù)據(jù)對比，找出一些候選研究對象。

然后是對lncRNA進行功能挖掘。常規(guī)使用的研究方法為：通過lncRNA預(yù)測miRNA和mRNA。而本研究采用通過找lncRNA和mRNA有無結(jié)合關(guān)系，直接從序列上進行預(yù)測。通過lncRNA和mRNA之間的表達豐度相關(guān)性推測lncRNA的功能。通過Banding到DNA來看轉(zhuǎn)錄調(diào)控，Banding到RNA來看降解、翻譯的過程。

1.3.5 RNA SYBR Green 熒光定量 PCR

使用含RNase抑制劑的高效cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行 cDNA 第一鏈合成，使用 Power SYBR Green PCR Master Mix進行 SYBR Green qPCR，將 9 μL 基因特異性qPCR反應(yīng)液和1μL的樣品加入384孔板中。將384 孔板置于 QuantStudio 5 Real-Time PCR System 中，用軟件 QuantStudio? Design & Analysis Software 運行，程序如下：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；（95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）40 循環(huán)。Gapdh 作為定量實驗內(nèi)參，引物采用Primer Express 3.0.1軟件設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過ceRNA機制分析挖掘功能circRNA

圖3展示了有顯著變化的經(jīng)典通路之間的聯(lián)系，圓形為mRNA，菱形為circRNA,線為miRNA。

圖3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖

通過條件circRNA與miRNA結(jié)合位點≥2進行數(shù)據(jù)篩選，然后與IPA結(jié)果進行關(guān)聯(lián)。通過數(shù)據(jù)對比，找出一些候選研究對象，如表1所示。其中與行為相關(guān)：SNAI2、GRP、NETO1、ARAF；與癌癥相關(guān)：SNAI2；與炎癥反應(yīng)相關(guān)：CD69、NFIL3、GRP。

2.2 通過ceRNA機制分析挖掘功能lncRNA

（1）差異交集lncRNA和mRNA：交集基因總表，計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)，篩選相關(guān)性高的，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)；得到lncRNA-mRNA共表達總表；（2）進行l(wèi)ncRNA篩選：選取degree最高的3個lncRNA（其大小可以衡量lncRNA的核心程度），分別將其共表達mRNA篩選出來，找到lncRNA和mRNA為同一SOM結(jié)果中的Base；（3）將篩選出的子網(wǎng)絡(luò)mRNA結(jié)果與IPA結(jié)果關(guān)聯(lián)，通過數(shù)據(jù)對比，找出一些候選研究對象。

表1 circRNA-mRNA候選研究對象

相同Base中的circRNA-mRNA，通過數(shù)據(jù)對比，找出一些候選研究對象。其中與行為相關(guān)：CRH、SLC6A4、UCN、CCKBR、FGF3。圖4展示預(yù)測構(gòu)建的lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，圖5為Degree最高的3個lncRNA-mRNA子網(wǎng)絡(luò)圖。

圖4 lncRNA-mRNA共表達圖

2.3 定量PCR驗證芯片結(jié)果

選擇17個基因，在18個樣本中驗證其表達情況并與芯片結(jié)果進行對比，每個樣品重復(fù)檢測3次，檢測結(jié)果取平均值。采用相對threshold cycle(2-ΔCt)方法計算相對表達水平，其中circRNA、lncRNA、mRNA定量以Gapdh作為內(nèi)參基因。如圖6所示，Aim1、cicRNA.14884、cicRNA.7871、cicRNA.8088、NR_003185、NR_045976、ENSMUST00000187198、Epb41l4a、Snai2和Zswim2的定量結(jié)果與芯片結(jié)果吻合。Real-Time PCR數(shù)據(jù)中橫坐標(biāo)為樣本名稱，縱坐標(biāo)為2-ΔCt。芯片數(shù)據(jù)中橫坐標(biāo)為樣本名稱，縱坐標(biāo)為芯片歸一化信號值。

圖5 Degree最高的3個lncRNA-mRNA子網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 定量PCR與芯片結(jié)果比較

3 討論與結(jié)論

實驗通過 mouse ceRNA 芯片對 0 h、2 d、6 h、7 d、14 d 和 28 d 這 6 個時間段的小鼠背根神經(jīng)節(jié)組織進行基因表達分析，篩選在背根神經(jīng)節(jié)中異常表達的基因，通過ceRNA機制分析挖掘功能circRNA、lncRNA。國內(nèi)外有很多通過ceRNA機制挖掘抑癌基因，研究腫瘤、呼吸系統(tǒng)等疾病因及診治的報道，但在背根神經(jīng)節(jié)中的研究尚屬首次。在此基礎(chǔ)上，為排除由于個體差異、組織異源性等因素引起的假陽性實驗結(jié)果，通過增加實驗的重復(fù)性和可靠性，對6個時間段的樣本都進行3次重復(fù)實驗，并應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對18例樣本挑選了17個基因進行Real Time PCR驗證。驗證結(jié)果顯示，mouse ceRNA芯片結(jié)果和實時熒光定量PCR結(jié)果一致，進一步證實了背根神經(jīng)節(jié)中l(wèi)ncRNA和circRNA的差異表達。目前，對于lncRNA和mRNA、circRNA和mRNA的自身表達調(diào)控及參與調(diào)控其他基因的網(wǎng)絡(luò)途徑缺乏了解，因此通過生物學(xué)技術(shù)來探討異常表達的這些基因的功能分類和調(diào)節(jié)途徑。通過ceRNA機制，篩選在相同Base中的circRNA-mRNA，進行預(yù)測miRNA，構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。一共找到1 733個有關(guān)系的circRNA-miRNA-mRNA，再次縮小范圍并和mRNA的IPA結(jié)果進行關(guān)聯(lián)，找到與行為相關(guān)的勾選研究對象：SNAI2、GRP、NETO1、ARAF；與免疫相關(guān)的候選研究對象：CD69、NFIL3、GRP。

接下來再利用lncRNA和mRNA挖掘lncRNA功能，并構(gòu)建靶基因與其調(diào)控的lncRNA網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。一共找到42個lncRNA-mRNA共表達關(guān)系，再次篩選Degree最高的3個lncRNA-mRNA子網(wǎng)絡(luò)，將篩選出的子網(wǎng)絡(luò)mRNA結(jié)果與IPA結(jié)果關(guān)聯(lián)，通過數(shù)據(jù)對比，找出一些行為相關(guān)候選研究對象：CRH、SLC6A4、UCN、CCKBR、FGF3。以上工作為進一步研究這些異常表達的基因在背根神經(jīng)節(jié)疼痛免疫等方面的發(fā)展提供了初步研究基礎(chǔ)。

上述工作僅僅是初步將芯片數(shù)據(jù)中的差異基因進行ceRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。接下來還可以進一步對上述利用生物信息學(xué)預(yù)測的基因進行驗證。其中包括利用雙熒光素酶報告實驗，RT-PCR等實驗驗證lncRNA/circRNA和mRNA的表達相關(guān)性，通過RIP等手段驗證lncRNA/circRNA和mRNA有共同的MRE，通過體外細胞實驗驗證靶RNA對miRNA有抑制作用，最后可以通過流式細胞實驗、體外動物實驗、臨床試驗等驗證靶基因的生物學(xué)功能。