尹子葉，張圓媛，李穎，劉婧涵，高月瀅，劉琳，皮付偉

（江南大學(xué)，江蘇無錫 214000）

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的多枝狀金納米粒子已成為一種新型納米材料[1]。多枝狀金納米粒子具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)如光學(xué)特性、生物親和性和較大的比表面積等[2]，其制備及應(yīng)用方面的研究已成為材料領(lǐng)域研究的前沿課題。多枝狀金納米顆粒安全性高、穩(wěn)定性好、易于制備且具有獨(dú)特的電學(xué)效應(yīng)、光學(xué)效應(yīng)和磁學(xué)效應(yīng)[3]，因此，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值。國內(nèi)外制備多枝狀金納米材料的方法主要包括兩種，分別是種子介導(dǎo)生長法和一步合成法。其中，種子介導(dǎo)生長法是目前運(yùn)用最為普遍的方法，具有很好的可控性，但周期較長、操作復(fù)雜，吸附在材料表面的表面活性劑難以去除，容易對(duì)后續(xù)的應(yīng)用造成影響。因此，通過實(shí)驗(yàn)改良了種子介導(dǎo)生長法的缺點(diǎn)，極大地縮短其周期，在10 s內(nèi)合成了無表面活性劑吸附的多枝狀金納米顆粒，命名為MSGNS。最新研究發(fā)現(xiàn)Anti-GPC3與金納米材料的結(jié)合能增強(qiáng)材料對(duì)HepG2細(xì)胞的遞送，這種以抗體搭建納米材料載體靶向癌癥細(xì)胞的研究思路，已被證實(shí)具有很好的實(shí)際應(yīng)用性[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯金酸（HAuCl4，純度≥99%）、鹽酸（HCl）等無機(jī)試劑購自國藥控股化學(xué)試劑有限公司（中國上海）。PBS緩沖液和胰蛋白酶等購自碧云天生物技術(shù)有限公司（中國上海）。DMEM基礎(chǔ)試劑購自Thermo Fisher Scientific（美國）。Anti-Glypican 3 抗體 [9C2]購自Abcam（英國劍橋）。

VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司；Avaspec 2048紫外-可見分光光度計(jì)，荷蘭；JEM-2100透射式電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會(huì)社；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器，上海百典儀器設(shè)備有限公司；EX-OHOUS電子天平，美國奧豪斯公司；Eppendorf離心機(jī)，德國艾本德公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MSGNS的合成

采用改進(jìn)的Turkevich方法制備MSGNS。金種子液：攪拌條件下將 100 mL 的 0.75 mmol/L HAuCl4溶液在水浴下回流，之后添加2.19 mL的155.2 mmol/L檸檬酸三鈉溶液。待溶液變?yōu)樯罴t色后，繼續(xù)回流15 min，在4 ℃保存。在室溫25 ℃劇烈攪拌下將80 μL AgNO3（10 mmol/L）和200 μL抗壞血酸（0.1 mol/L），同時(shí)添加到含有 19.208 mL 超純水、0.4 mL HAuCl4（25 mmol/L）、40 μL HCl（1 mol/L）和 72 μL 金種子液的混合溶液中，10 s后溶液顏色由粉紅色變?yōu)樗{(lán)色。

1.2.2 MSGNS-GPC3的構(gòu)建

將 2 mL 制備好的納米溶液與 6 mL Bicine 緩沖液混合，以 1 300 r/min 的速度攪拌，然后加入 20 mg固體粉末狀巰基聚乙二醇（Mercapto polyethylene glycol，SH-PEG），在25 ℃下以1 000 r/min的速度攪拌36 h。超純水離心洗滌 3 次（6 000 r/min，5 min），4 ℃保存。用蒸餾水將 Anti-GPC3（1 mg/mL）稀釋100倍，將其與MSGNS以1∶20體積比混合4 ℃孵育 12 h。8 000 r/min 離心 10 min，倒出上清液，原始濃度稀釋沉淀物得到MSGNS-GPC3。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的細(xì)胞在37 ℃水浴條件下溶解，800 r/min離心5 min去掉凍存液，用5 mL完全培養(yǎng)基（胎牛血清FBS、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基DMEM體積比1∶9）重懸細(xì)胞，將相同濃度（100 μg/mL）的MSGNS-GPC3和MSGNS分別與HepG2細(xì)胞在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。

2 結(jié)果和討論

2.1 合成多枝狀金納米顆粒過程中不同時(shí)間點(diǎn)的表征

將合成MSGNS過程中出現(xiàn)在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（5 s、7 s、10 s）的溶液進(jìn)行 TEM 和紫外測試，加入Vc和硝酸銀的時(shí)間點(diǎn)為0 s。如圖1和表1所示，5 s的溶液呈粉紅色且此時(shí)金納米顆粒呈球形，在580 nm處出現(xiàn)一個(gè)特征峰；7 s的溶液變成淺藍(lán)色，顆粒呈有觸角的球形，特征吸收峰遷移到1 030 nm；10 s時(shí)得到MSGNS溶液為深藍(lán)色，TEM清晰顯示多枝狀金納米顆粒的分枝。根據(jù)經(jīng)典的Turkevich方法的機(jī)理，結(jié)合文獻(xiàn)[5]中觀察到的種子介導(dǎo)的金納米球向金納米六角形星的生長過程，可以得出結(jié)論，合成的MSGNS是通過Au原子各向異性而使得Au逐漸沉積在添加的種子上而合成。

圖1 合成多枝狀金納米顆粒過程中不同時(shí)間點(diǎn)的表征

2.2 金納米顆粒在不同狀態(tài)下的粒徑和分散度

MSGNS和改性后MSGNS的直徑大?。―IA）和分散性（PDI）見表1。如表1所示，MSGNS-GPC3的平均粒徑為（277.67±2.36）nm，遠(yuǎn)大于MSGNSPEG的（212.68±2.61）nm和 MSGNS的（188.82±3.26）nm，PDI值均小于0.2，結(jié)果表明MSGNSGPC3構(gòu)建成功且分散性良好。

表1 金納米顆粒在不同狀態(tài)下的粒徑和分散度

2.3 MSGNS-GPC3和MSGNS分別與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)

將MSGNS-GPC3和MSGNS-PEG分別與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)，如圖3所示。兩組細(xì)胞在0.5 h內(nèi)沒有顯著差異。4 h后，少量MSGNS-PEG通過內(nèi)吞作用存在于細(xì)胞體內(nèi)，12 h后則大量聚集在細(xì)胞內(nèi)部。相反，MSGNS-GPC3即使培養(yǎng)時(shí)間長達(dá)12 h，也不發(fā)生胞吞和聚集，而是被吸附在細(xì)胞膜上。結(jié)果表明，多枝狀金納米顆粒-GPC3可以在HepG2細(xì)胞膜上長時(shí)間共存。

圖3 MSGNS-PEG（d、e、f）和 MSGNS-GPC3（a、b、c）分別與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)的時(shí)間分辨光學(xué)圖

3 結(jié)論

本文合成了多枝狀金納米顆粒并分析其合成機(jī)理，將其與Anti-GPC3偶聯(lián)后發(fā)現(xiàn)其可以被吸附在HepG2細(xì)胞膜表面上且長時(shí)間與細(xì)胞共存。研究提供了合成多枝狀金納米材料的新方法，相比以前的方法其效率更高且不形成表面活性劑，有利于多枝狀金納米顆粒后續(xù)的修飾與應(yīng)用，同時(shí)其細(xì)胞界面上的吸附性在癌細(xì)胞的診療方面具有很好的應(yīng)用潛力。