孫真真，溫航衛(wèi)，陶鳳姣，游亞蘭，彭新平

作者單位：1邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 邵陽 422000；2湖南省人民醫(yī)院兒科，湖南 長沙410000

川崎病是一種全身非特異性的血管炎性疾病，主要發(fā)生于5歲以下的兒童[1]。目前，川崎病的發(fā)生機(jī)制尚不明確。研究顯示，川崎病的發(fā)生與冠狀動脈或中等肌性動脈內(nèi)皮組織損傷有關(guān)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是川崎病冠狀動脈損傷的重要原因[2]。程序性細(xì)胞死亡因子4（programmde cell death 4，PDCD4）是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的凋亡調(diào)控因子，其可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)影響細(xì)胞的生長凋亡[3]。PDCD4不僅在人類的皮膚、肺臟、結(jié)腸、卵巢等組織中表達(dá)，在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞中也有表達(dá)，并且對于不同的細(xì)胞凋亡調(diào)控作用不同[4-5]。研究顯示，PDCD4在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)升高，其可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。2017年3月至2018年4月，本研究以明確PDCD4在川崎病血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用為目的，為明確川崎病血管內(nèi)皮損傷發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 編號128人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購自美國ScienCell；PDCD4抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；9661活化型Caspase-3（C-Caspase-3）抗體、9505活化型Caspase-9（C-Caspase-9）抗體購自美國Isoimperatorin；DP405RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2505311逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Qiagen；SR1100 Real-time PCR試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司；Applied Biosystems PCR儀購自美國Thermo；R1200細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；IPVH00010 PVDF膜購自美國Millipore；M2003 MTT試劑購自美國Sigma；Stratagene MX3005P Realtime PCR儀購自美國安捷倫；HBS-1096A酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；IX73倒置顯微鏡購自日本Olympus。

1.2 血清分離 采集2017年5月邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院典型川崎病病兒急性期和年齡相仿的健康兒童各5例的靜脈血4 mL，小兒川崎病診斷和納入標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，研究對象和正常對照的基本資料，年齡、性別和其它臨床資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。標(biāo)本采集經(jīng)過病人及其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。在4℃，4 000 g離心15 min以后，吸取血清，保存在-80℃。實驗前以0.22 μm微孔過濾器過濾。

1.3 Realtime PCR檢測川崎病血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞中PDCD4表達(dá)影響 血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用含有體積分?jǐn)?shù)為10%川崎病血清和體積分?jǐn)?shù)為10%的正常血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為川崎病血清組和正常血清組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，用Realtime PCR方法測定細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平。步驟為：用細(xì)胞總RNA提取試劑盒（TRIZOL）分別提取細(xì)胞中的總RNA，RNA用DEPC水溶解并保存在-80℃冰箱中。RNA濃度及純度檢測用紫外分光光度計（其OD260nm和OD280nm的比值在1.8～2.0之間）。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成各組cDNA。引物用Primer 5.0軟件設(shè)計，引物均由上海生工合成。PDCD4正向引物5′-CCAAAGAAAGGTGGTGCA-3′，反向引物5′-TGAGGTACTTCCAGTTCC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物5′-CAACGGATTTGGTCGTATT-3′，反向引物 5′-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。再依照Real-time PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR。以2-ΔΔCT法計算PDCD4表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)參，取內(nèi)參和目的基因的Ct值的均值，ΔCt＝Ct目的-Ct內(nèi)參，ΔΔCt＝[轉(zhuǎn)染組目的基因Ct值-轉(zhuǎn)染組內(nèi)參基因Ct值]-[對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值]

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中PDCD4、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（C?Caspase?3）、C?Caspase?9蛋白表達(dá)變化 取上述川崎病血清組和正常血清組細(xì)胞，添加D-hanks液將細(xì)胞洗滌3次，將孔內(nèi)的液體分別吸盡，再添加含有苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，放在冰上反應(yīng)10 min把裂解溶液收集轉(zhuǎn)移到離心管中，以功率為80 W的超聲儀超聲3次，每次2 s，間隔4 s超聲后，繼續(xù)置于冰上裂解10 min。以4℃，12 000 g離心20 min，把蛋白上清液轉(zhuǎn)移并保存。吸取蛋白樣品，依照BCA方法分別檢測蛋白濃度。將蛋白樣品添加至同體積的2×上樣緩沖液中混勻，以100℃煮沸5 min，每個孔中上樣量為40 μg。設(shè)置濃縮膠中電泳電壓為70 V，電泳30 min以后，設(shè)置分離膠中電壓為120 V，電泳90 min。裁剪合適大小的PVDF膜，置于4℃，100 V條件下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜進(jìn)行70 min。以5%牛血清白蛋白封閉液在37℃孵育90 min后，再與400倍稀釋的PDCD4一抗在室溫中孵育2 h，PVDF膜同1∶2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在37℃孵育90 min以后，分別滴加顯色液，測量蛋白灰度值，GAPDH作為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白水平＝目的蛋白灰度值÷GADPH灰度值。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 血管內(nèi)皮細(xì)胞匯合度為40%時添加病毒液，MOI＝30，病毒感染12 h后進(jìn)行換液，用嘌呤霉素2 μg/mL抗性篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PDCD4 siRNA和siRNA Control后用含有體積分?jǐn)?shù)為10%川崎病血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為si-PDCD4＋川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組。川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，按照1.3和1.4中Realtime PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平。

1.6 MTT檢測下調(diào)PDCD4對川崎病血清條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響 血管內(nèi)皮細(xì)胞以密度為2×104/mL種植到96孔板內(nèi)，按照正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組分組處理，在培養(yǎng)24 h以后將培養(yǎng)板取出。每個孔內(nèi)添加20 μL的MTT溶液，放置于37℃孵育4 h，將上清溶液吸棄，繼續(xù)添加150 μL的DMSO，放置于搖床上震蕩10 min。測定波長570 nm的OD值，以不含細(xì)胞的孔調(diào)零，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝（實驗組OD值÷正常血清組OD值）×100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)PDCD4對川崎病血清條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響 按照正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，以PBS洗滌3次，制成單細(xì)胞懸浮液。1 000g離心10 min，分別在細(xì)胞中添加195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液，再添加10 μL的PI，放置于避光環(huán)境孵育15 min以后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。觀測資料均為計量資料，用表示，兩組比較為兩獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川崎病血清處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平檢測結(jié)果 正常血清組和川崎病血清組細(xì)胞中 PDCD4 mRNA 水平分別為：（1.00±0.01）、（3.51±0.36），PDCD4蛋白蛋白水平分別為：（0.26±0.08）、（0.57±0.06）。川崎病血清組細(xì)胞中PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)高于正常血清組（P＜0.05）。

2.2 PDCD4 siRNA對川崎病血清處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中PDCD4表達(dá)影響檢測結(jié)果 川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組和si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞中PDCD4 mRNA水平為：（1.00±0.01）、（0.91±0.09）、（0.41±0.06），PDCD4 蛋白水平為：（0.64±0.06）、（0.65±0.08）、（0.30±0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞中PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。

2.3 下調(diào)PDCD4對川崎病血清條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響檢測結(jié)果 正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞存活率為：（100.00±0.00）%、（72.01±7.32）%、（71.57±9.05）%、（89.52±6.80）%。川崎病血清組細(xì)胞存活率低于正常血清組（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞存活率高于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。

2.4 下調(diào)PDCD4對川崎病血清條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響檢測結(jié)果 正常血清組、川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組、si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞凋亡率為：（6.32±0.58）%、（21.26±2.31）%、（22.58±1.79）%、（16.47±1.24）%。川崎病血清組細(xì)胞凋亡率高于正常血清組（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞凋亡率低于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。見圖1。

2.5 下調(diào)PDCD4對川崎病血清條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞中C?Caspase?3、C?Caspase?9蛋白表達(dá)影響檢測結(jié)果 川崎病血清組細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平高于正常血清組（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清組細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平低于川崎病血清組、si-NC＋川崎病血清組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

川崎病可引起心肌炎、冠狀動脈擴(kuò)張、心臟病等并發(fā)癥，研究顯示，川崎病血管內(nèi)皮功能損傷是其發(fā)生的重要原因之一[8]。川崎病病人血清可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖[9]。本研究的結(jié)果顯示，川崎病病人血清處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞增殖能力降低，說明川崎病血清具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)PDCD4對川崎病血清處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響

表1 下調(diào)PDCD4后對川崎病血清處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)影響/

表1 下調(diào)PDCD4后對川崎病血清處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)影響/

注：PDCD4為程序性細(xì)胞死亡因子4；C-Caspase-3為活化型Caspase-3，C-Caspase-9為活化型Caspase-9；與正常血清組比較，aP＜0.05；與川崎病血清組比較，bP＜0.05；與si-NC＋川崎病血清組比較，cP＜0.05

images/BZ_104_238_461_1192_520.png0.27±0.04 0.56±0.08a 0.57±0.05 0.41±0.02bc 22.193 0.000正常血清組川崎病血清組si-NC＋川崎病血清組si-PDCD4＋川崎病血清組F值P值6 6 6 6 0.18±0.03 0.33±0.04a 0.35±0.06 0.25±0.03bc 10.443 0.004

PDCD4是在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)基因，后續(xù)在人類和大鼠體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有PDCD4表達(dá)。人類PDCD4基因定位于10q24染色體上，其cDNA全長為3.5 kb。PDCD4編碼的基因由469個氨基酸組成，其氨基端含有兩個α-螺旋結(jié)構(gòu)域，這兩個α螺旋結(jié)構(gòu)能夠同翻譯起始因子結(jié)合，從而抑制核糖體復(fù)合物的形成及蛋白質(zhì)的合成[10-12]。PDCD4參與細(xì)胞的凋亡過程，其過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。研究顯示，PDCD4在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平的高低與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[14]。本研究的結(jié)果表明，川崎病病人血清處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中PDCD4表達(dá)上調(diào)，下調(diào)PDCD4能夠抑制川崎病血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示PDCD4可能參與川崎病血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑，其發(fā)生受到細(xì)胞內(nèi)多種基因和蛋白的調(diào)控。研究顯示，Caspase蛋白家族參與細(xì)胞凋亡發(fā)生，其中Caspase-3等是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)物，Caspase-9等參與細(xì)胞凋亡激活和打靶等過程。Caspase蛋白家族成員以沒有活性的酶原形式存在，其只有被激活后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[15-17]。Caspase蛋白家族成員參與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程，在動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病等血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中均已經(jīng)證實[18-19]。本研究的結(jié)果顯示，川崎病血清可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9，說明川崎病血清可能通過活化細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。我們的實驗還表明下調(diào)PDCD4后，川崎病血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平降低，提示下調(diào)PDCD4可能通過降低川崎病血清誘導(dǎo)的細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的活化減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

總而言之，川崎病血清可以通過上調(diào)PDCD4的表達(dá)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，下調(diào)PDCD4表達(dá)降低了川崎病血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為以后研究川崎病發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為研究PDCD4在川崎病發(fā)生中的作用提供了參考。本研究只在體外進(jìn)行了細(xì)胞實驗，沒有在體內(nèi)及原代血管內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行驗證，在后續(xù)實驗中會對這部分內(nèi)容進(jìn)行探討。