張雪翠 鐘 超 段燦星 孫素麗,* 朱振東,*

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京100081; 2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 遼寧沈陽110866

大豆[Glycine max(L.) Merrill], 不僅是世界上 的主要油籽作物, 也是食用、飼料和工業(yè)原料的重要來源。近年來, 大豆種植面積不斷下降, 而國內(nèi)需求卻不斷增長, 導(dǎo)致國內(nèi)大豆供需不平衡, 對外依存度很高, 使我國成為世界上最大的大豆進口國[1]。在大豆生產(chǎn)中, 大豆病害是限制大豆高產(chǎn)的一個重要因素。其中, 由大豆疫霉(Phytophthora sojaeKauf. &Gerd)引起的大豆疫霉病是一種破壞性大豆病害, 顯著影響大豆產(chǎn)量, 其危害程度僅次于大豆胞囊線蟲病[2-3]。大豆疫霉病于20 世紀(jì)80年代末在我國東北地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn), 之后該病害的發(fā)病區(qū)域在中國大豆產(chǎn)區(qū)不斷擴大。迄今, 大豆疫霉病在內(nèi)蒙古自治區(qū)、福建省、新疆維吾爾自治區(qū)、黃淮海地區(qū)以及長江流域均有發(fā)生[4]。

大豆疫霉是一種土傳性植物病原菌, 其卵孢子可以在土壤中存活數(shù)年, 在適宜條件下卵孢子萌發(fā)形成孢子囊, 隨后釋放游動孢子侵染植株[5]。大豆疫霉在大豆的整個生育期均可侵染大豆。培育抗病品種是控制大豆疫霉病最為有效、經(jīng)濟和環(huán)境友好的措施[6-7]。大豆對大豆疫霉的抗性有 2種類型, 即由單個顯性基因控制的質(zhì)量抗性和由多個微效基因控制的數(shù)量抗性[8]。通常數(shù)量抗性具有廣譜性和持久性, 但不能抵御較強病害壓力且在常規(guī)育種中很難利用, 因此質(zhì)量抗性基因的發(fā)掘與利用一直是研究的重點。迄今, 已在大豆2 號、3 號、7 號、10 號、13 號、14 號和16～19 號染色體上鑒定了30 多個抗疫霉病基因, 其中3 號染色體上最多[9-12]。然而, 研究表明, 在已鑒定的抗疫霉病基因中, 僅Rps1c、Rps1k、RpsYD25和RpsYD29等能夠抵御我國的大豆疫霉種群[13-16]。因此, 需要不斷挖掘新的大豆抗疫霉病基因, 以保障大豆抗病育種的可持續(xù)性。

大豆品種鄭97196 是2008年由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物所利用鄭100 為母本、鄭93048 為父本雜交選育而成, 具有抗花葉病毒病、紫斑病、大豆胞囊線蟲和抗倒伏的優(yōu)良特性[17-18], 是當(dāng)前黃淮地區(qū)主要大豆栽培品種之一。前期, 本研究團隊發(fā)現(xiàn)鄭97196 對大豆疫霉具有很寬的抗譜[19], 張海鵬等[20]在其 3 號染色體上初步定位了一個抗疫霉病基因RpsZheng。本研究將利用抗、感親本的全基因組重測序數(shù)據(jù)繼續(xù)開發(fā)與抗疫霉病基因RpsZheng連鎖的分子標(biāo)記, 縮小RpsZheng的候選基因組區(qū)域, 開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于抗病基因分析的大豆品種為抗疫霉病品種鄭97196、23 個含有單一抗疫霉病基因的大豆品種以及3 個感病對照品種(Williams、中黃13 和豫豆21)(表1), 用于驗證共分離分子標(biāo)記品種為226 個已知抗性表型的大豆品種(附表1), 用于抗病基因作圖的群體為Williams 與鄭97196 雜交衍生的188 個F2：3家系。所有試驗材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 大豆疫霉

用于本研究的10 個大豆疫霉分離物分別由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超教授、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)張淑珍教授和本研究室提供(表1)。分離物在10℃下保存, 使用時在V8汁瓊脂培養(yǎng)基上活化, 24℃培養(yǎng)8～10 d, 用于接種。

1.3 抗病性鑒定

選取抗病親本鄭97196、感病親本W(wǎng)illiams 以及23 個含有單一抗疫霉病基因的大豆品種和感病對照中黃13 和豫豆21 各15～20 粒種子, 作圖群體每個家系選取20～25 粒種子, 播種在以蛭石為基質(zhì)的1000 mL 紙杯中, 播種后在25℃溫室培養(yǎng); 每個品種播種10 杯, 分別接種10 個大豆疫霉分離物, 作圖群體F2：3家系用分離物PsJS2 進行抗性鑒定。待植株第一對真葉平展開后, 采用下胚軸創(chuàng)傷接種法進行接種[16,21-22]。接種時, 先用注射器針頭在大豆植株子葉下方1 cm 處下胚軸劃長約1 cm 的傷口, 再用注射器在傷口上注射約0.2 mL 的接種體。將接種后植株置23～25℃、濕度為100%的保濕間內(nèi)保濕48 h, 然后轉(zhuǎn)入25℃溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3 d 進行表型調(diào)查[21-23]?？剐栽u價參照Zhang 等[21-22]的標(biāo)準(zhǔn), 每個品種或家系的死亡率小于21%, 記為抗病(resistant, R); 植株死亡率在 21%～79%之間, 記為中間類型或雜合(segregating, Rs); 植株死亡率大于79%, 記為感病(susceptible, S)。試驗重復(fù)2 次, 重復(fù)2 次結(jié)果不一致的進行第3 次鑒定。

1.4 大豆基因組DNA 的提取

親本W(wǎng)illiams 和鄭97196 及作圖群體的每個F2：3家系分別等量采集15～20 個植株的混合葉片, 采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒(離心柱)(天根生物科技, 中國北京), 參照其使用說明提取基因組DNA。

表1 28 個大豆品種對10 個大豆疫霉分離物的抗性反應(yīng)型Table 1 Phenotypic reaction of 28 cultivars, with and without Rps genes, against 10 Phytophthora sojae isolates

1.5 SSR 分析及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

基于張海鵬等[20]對RpsZheng的初步定位結(jié)果,選擇位于大豆3 號染色體上已經(jīng)公布的SSR 標(biāo)記在Williams 和鄭97196 之間進行多態(tài)性篩選[21,24]。SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為10 μL, 包含上下游引物各0.2 μL、2 ×TaqPCR MasterMix (Tiangen) 4 μL、模板DNA 2 μL(20 ng), ddH2O 補足至10 μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性 5 min; 94℃變性45 s, 55℃退火45 s (不同引物退火溫度略有不同), 72℃延伸45 s, 35 個循環(huán); 72℃延伸 10 min, 4℃保溫。在 PCR 產(chǎn)物中加入 2 μL 6×loading buffer, 用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物, 篩選出的親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記用于鑒定188 個F2：3家系基因型。

基于群體表型和基因型鑒定結(jié)果, 用作圖軟件MAPMAKER/EXP version 3.0 進行遺傳連鎖分析[25],遺傳距離的計算依據(jù) Kosambi 作圖函數(shù)[26], loglikelihood 似然值設(shè)置為3.0。采用MapDraw 軟件繪制遺傳連鎖圖譜[27]。

1.6 InDel 標(biāo)記的開發(fā)及精細作圖

基于構(gòu)建的抗疫霉病基因RpsZheng遺傳連鎖圖譜, 在 Williams 82 參考基因組中(https：//www.soybase.org/)獲得抗疫霉病基因RpsZheng兩側(cè)最緊密連鎖的分子標(biāo)記的物理位置, 以確定抗病基因候選區(qū)域在大豆基因組的物理區(qū)間。利用二代測序技術(shù)對親本W(wǎng)illiams 和鄭97196 進行全基因組重測序,基于2 個親本品種的全基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)抗病基因候選區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性InDel 標(biāo)記, 用于進一步精細定位抗疫霉病基因。采用NCBI 引物設(shè)計工具Primer-BLAST (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計引物, PCR 程序與電泳檢測方法參照SSR 標(biāo)記的檢測方法。

1.7 共分離標(biāo)記的特異性檢測

對RpsZheng候選區(qū)域內(nèi)開發(fā)的共分離標(biāo)記在23 個含有已知抗疫霉病基因大豆品種和226 個大豆品種中進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性表型鑒定

3 個感病品種Williams、中黃13 和豫豆21 所有植株接種10 個大豆疫霉分離物后全部死亡, 抗病親本鄭97196 植株接種后100%存活且未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀,表現(xiàn)出完全抗性, 其他23 個含有單一抗疫霉病基因的大豆品種分別抗3～10 個分離物, 共產(chǎn)生了16 種抗性反應(yīng)類型, 其中鄭97196 的抗性反應(yīng)型與魯豆4 號、齊茶豆1 號以及岫94-11 的抗性反應(yīng)型一致(表1)。

Williams 與鄭97196 雜交衍生的188 個F2：3家系接種大豆疫霉分離物PsJS2 后, 47 個鑒定為抗病家系, 91 個為抗、感分離的雜合家系, 50 個為感病家系。通過卡平方檢驗(χ2), 抗病家系∶雜合家系∶感病家系符合1∶2∶1 的期望分離比, 表明鄭97196對大豆疫霉PsJS2 的抗性是由一個顯性單基因控制(表2), 與張海鵬等[20]接種大豆疫霉分離物HeN35的結(jié)果一致。

2.2 SSR 標(biāo)記分析和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

張海鵬等[20]將鄭97196 的抗大豆疫霉病基因RpsZheng定位在大豆3 號染色體的SSR 標(biāo)記satt485和satt584 之間, 遺傳距離分別為2.1 cM 和3.7 cM。本研究選擇3 號染色體已經(jīng)公布的311 個SSR 標(biāo)記在Williams 和鄭97196 之間進行多態(tài)性篩選, 獲得16 個多態(tài)性SSR 標(biāo)記, 即BARCSOYSSR_03_0108、BARCSOYSSR_03_0151、BARCSOYSSR_03_0247、BARCSOYSSR_03_0250、BARCSOYSSR_03_0269、BARCSOYSSR_03_0300、BARCSOYSSR_03_0315、BARCSOYSSR_03_0344、BARCSOYSSR_03_0358、BARCSOYSSR_03_0382、Satt159、SattWM82_39、Satt1k3、Sat_084、Satt485 和Satt125, 其中Satt159、Satt485 和Satt125 為張海鵬等構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的標(biāo)記[20]。用這些標(biāo)記進一步鑒定F2：3群體的188 個家系基因型。對188 個F2：3家系的表型和基因型結(jié)果進行連鎖分析表明, 這16個SSR標(biāo)記均與抗疫霉病基因連鎖, 抗疫霉病基因定位在標(biāo)記SattWM82_39 和BARCSOYSSR_03_0269 之間, 遺傳距離分別為2.5 cM 和 1.0 cM, 標(biāo)記 BARCSOYSSR_03_0247、BARCSOYSSR_03_0250 和Satt1k3 與抗疫霉病基因共分離(圖1-A)。本研究定位的鄭97196 抗疫霉病基因與張海鵬等定位的RpsZheng具有3 個相同的連鎖標(biāo)記Satt159、Satt485 和Satt125[20], 表明為同一個基因。

2.3 InDel 標(biāo)記精細定位抗病基因

在大豆Williams 82 參考基因組上, 抗疫霉病基因側(cè)翼標(biāo)記 SattWM82_39 和 BARCSOYSSR_03_0269 間的物理距離為959.7 kb。為了進一步縮短RpsZheng定位區(qū)間的物理距離, 對Williams 和鄭97196 進行了全基因組重測序, 基于測序數(shù)據(jù)鑒定出Williams 和鄭97196 在抗病基因候選區(qū)域959.7 kb 的InDel 位點, 開發(fā)了15 個親本間多態(tài)性InDel標(biāo)記。進一步用這些標(biāo)記鑒定作圖群體基因型, 結(jié)果表明15 個InDel 標(biāo)記在群體中均呈現(xiàn)出1∶2∶1分布, 為共顯性標(biāo)記(附表2)。遺傳連鎖分析表明, 15個InDel 標(biāo)記均與抗疫霉病基因連鎖。

表2 Williams 和鄭97196 及其雜交衍生的F2:3 群體對大豆疫霉分離物PsJS2 抗性遺傳分析Table 2 Genetic analysis of resistance to Phytophthora sojae isolate PsJS2 in the F2:3 population derived from Williams×Zheng 97196

基于作圖群體抗性表型和SSR、InDel 標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建抗疫霉病基因遺傳連鎖圖, 抗疫霉病基因被定位在InDel 標(biāo)記WZInDel7 和WZInDel12 之間, 與2 個標(biāo)記的遺傳距離分別為0.1 cM 和0.5 cM,在Williams 82 參考基因組(Glycine maxV2.0)上的物理 距 離 為 105.2 kb, WZInDel8 、 WZInDel9 、WZInDel10 和WZInDel11 四個標(biāo)記與抗疫霉病基因共分離(圖1-B, C)。根據(jù)大豆基因組Glycine maxV2.0 注釋, 在該定位區(qū)間內(nèi)共存在11 個基因模型(表3), 其中Glyma.03g035300和Glyma.03g036000含有Ser/Thr 蛋白激酶結(jié)構(gòu), 推測為最佳抗病候選基因。

圖1 RpsZheng 定位區(qū)域遺傳連鎖圖和物理圖Fig. 1 Genetic and physical maps of the RpsZheng region

表3 大豆3 號染色體上RpsZheng 定位區(qū)間內(nèi)(105.2 kb)的基因及注釋(Glycine max V2.0)Table 3 Gene and gene annotation of the 105.2 kb genomic region for RpsZheng on chromosome 3 (Glycine max V2.0)

2.4 共分離標(biāo)記的特異性檢測

為了驗證抗疫霉病基因RpsZheng的7 個共分離標(biāo)記的特異性, 用這些標(biāo)記鑒定23 個含有已知抗疫霉病基因的大豆品種和感病品種Williams、豫豆21號和中黃13, 發(fā)現(xiàn)除Williams 79 (Rps1c)、豫豆29(RpsYD29)和豫豆25 (RpsYD25)外, 標(biāo)記WZInDel11能夠區(qū)分RpsZheng與其他含抗疫霉病基因及感病品種(圖2-A), 表明該標(biāo)記能夠有效鑒定RpsZheng。為了進一步驗證WZInDel11 的特異性, 利用該標(biāo)記鑒定226 個大豆品種, 結(jié)果只在豫豆23、鄭92116、周豆11、皖豆24、皖豆29 和皖宿2156 中檢測到目標(biāo)條帶(圖2-B)(附表1)。對目的片段測序結(jié)果表明,Williams 79 (Rps1c)、豫豆29 (RpsYD29)和豫豆25(RpsYD25)、豫豆23、鄭92116、周豆11、皖豆24、皖豆29 和皖宿2156 的DNA 序列與鄭97196 的一致性為100%, 表明這9 個品種含有WZInDel11 標(biāo)記。

圖2 標(biāo)記WZInDel11 在大豆品種中的分子檢測結(jié)果Fig. 2 Detection of marker WZInDel11 in soybean cultivars

3 討論

利用含有抗疫霉病基因的大豆品種是防治大豆疫霉病最為有效、經(jīng)濟和安全的措施[10]。然而, 大豆抗疫霉病基因的有效期通常只能持續(xù)8～15年, 因此, 需要不斷挖掘新的抗疫霉病基因[30]。通過精細定位抗疫霉病基因及開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記可以為抗病育種提供分子輔助選擇的有效標(biāo)記, 從而加速大豆抗病育種的進程。前人研究已經(jīng)證明, 大豆品種鄭97196 對大豆疫霉具有廣譜抗性[19], 本研究結(jié)果表明, 鄭97196 對選擇的10 個不同毒力型的大豆疫霉分離物均表現(xiàn)為抗病, 進一步證明鄭97196是優(yōu)異的大豆疫霉病抗源。本研究用強毒力大豆疫霉分離物PsJS2 對作圖群體進行表型鑒定, 遺傳分析證明鄭97196 對分離物PsJS2 的抗性由一個顯性單基因控制, 與前期用分離物HeN35 鑒定的結(jié)果一致[20]。進一步利用SSR 標(biāo)記對鄭97196 中的抗疫霉病基因進行定位, 將抗疫霉病基因定位在3 號染色體SattWM82_39 和BARCSOYSSR_03_0269 之間,并與RpsZheng的已知連鎖標(biāo)記Satt159、Satt485 和Satt125 連鎖, 表明鄭97196 對分離物PsJS2 的抗性也由RpsZheng控制[20]。

迄今, 除RpsZheng外, 已經(jīng)在大豆3 號染色體上定位了16 個Rps基因, 包括Rps1的5 個等位基因[29]、Rps7[30]、Rps gene in Waseshiroge[31]、Rps9[32]、

RpsQ[16]、RpsYD29[21]、RpsYD25[33-34]、RpsUN1[23,35]、RpsWY[36]、RpsHN[37]、RpsHC18[10]、RpsX[12]。依據(jù)大豆Williams 82 參考基因組分析候選區(qū)域, 這些Rps基因都位于3 號染色體上的一個抗病基因簇[21,23,35,37]。本研究基于親本間全基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)InDel 標(biāo)記對RpsZheng進行精細作圖, 最終將該基因定位在一個 105.2 kb 的區(qū)域內(nèi), 并獲得BARCSOYSSR_03_0247、BARCSOYSSR_03_0250、Satt1k3、WZInDel8、WZInDel9、WZInDel10 和WZInDel11 七個共分離標(biāo)記。在構(gòu)建的RpsZheng遺傳連鎖圖和物理圖譜中, 除標(biāo)記 Satt1k3 和BARCSOYSSR_03_0247 外, 其余14 個SSR 標(biāo)記和15 個InDel 標(biāo)記的順序與參考基因組中的物理位置相一致, 表明本研究定位RpsZheng的準(zhǔn)確性。Satt1k3 和BARCSOYSSR_03_0247 在遺傳圖譜位置上的不一致, 可能是作圖群體間遺傳背景的差異所致[21-22]。Satt1k3 是基于克隆Rps1k基因序列開發(fā)的SSR 標(biāo)記, Zhang 等[21]發(fā)現(xiàn)RpsYD29與Satt1k3 遺傳距離為1 cM。最近, 鐘超發(fā)現(xiàn)RpsYD25與Satt1k3遺傳距離為2.2 cM (鐘超, 未發(fā)表數(shù)據(jù))。在本研究中,RpsZheng與標(biāo)記Satt1k3 共分離, 表明RpsZheng與RpsYD25和RpsYD29位于3 號染色體的相同基因簇, 與Rps1座位緊密連鎖或是Rps1座位的等位基因。RpsZheng也定位在已經(jīng)發(fā)表的大豆抗疫霉病基因RpsHN候選區(qū)域[37]。但是, Niu 等[37]用8 個大豆疫霉分離物對含有RpsHN的大豆品種蒙8206 進行抗性鑒定, 發(fā)現(xiàn)該品種僅對一個分離物表現(xiàn)抗性。鐘超等用本研究的10 個分離物鑒定蒙8206 的抗性,發(fā)現(xiàn)該品種僅抗 PsRace1 (鐘超, 未發(fā)表數(shù)據(jù))。RpsZheng與RpsHN對大豆疫霉分離物的抗譜存在很大差異, 所以不可能為同一個基因, 推測RpsZheng與RpsHN可能是等位基因或者是緊密連鎖的基因。雖然本研究未能通過抗譜將鄭97196 與岫94-11、齊茶豆1 號和魯豆4 號區(qū)分開, 但是岫94-11、齊茶豆1 號和魯豆4 號抗疫霉病基因均被定位在與RpsZheng不同的區(qū)域, 表明RpsZheng不同于RpsX、RpsQ和Rps9[12,16,32]。

為了發(fā)掘抗疫霉病基因的特異性標(biāo)記, 本研究用獲得的RpsZheng共分離標(biāo)記對含有已知抗疫霉病基因的大豆品種及3 個感病對照品種進行了檢測,發(fā)現(xiàn)除Williams 79 (Rps1c)、豫豆29 (RpsYD29)和豫豆25 (RpsYD25)外, 標(biāo)記WZInDel11 能夠有效地將RpsZheng與其他抗疫霉病基因區(qū)分, 含Rps1c的Williams 79、含RpsYD25的豫豆25 以及含RpsYD29的豫豆29 中存在WZInDel11 目標(biāo)片段(圖2-A), 且目標(biāo)片段DNA 序列與鄭97196 的一致性為100%。該標(biāo)記不能區(qū)分Rps1c、RpsYD25、RpsYD29和RpsZheng,表明這4 個基因有可能是等位基因, 而WZInDel11位于基因組非編碼區(qū), 并不是RpsZheng的功能標(biāo)記。Rps1c、RpsYD25、RpsYD29和RpsZheng都定位在3號染色體相同的抗病基因簇, 具有對大豆疫霉相似的抗譜, 且RpsYD25、RpsYD29和RpsZheng具有相同祖先[38], 抗性上的差異可能因為遺傳背景的不同或在選育過程中發(fā)生遺傳變異所導(dǎo)致。用標(biāo)記WZInDel11 對226 個大豆品種進行檢測, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豫豆23、鄭92116、周豆11、皖豆24、皖豆29 和皖宿2156 中檢測到目標(biāo)片段(圖2-B)(附表1), 且目標(biāo)片段DNA 序列與鄭97196 的一致性為100%, 系譜表明這些品種與鄭97196 有共同的祖先或親緣關(guān)系較近[38-41],推測在這些大豆品種中含有抗疫霉病基因RpsZheng或其等位基因。事實上, 除對大豆疫霉分離物PSJS2感病外, 豫豆23、周豆11、皖豆24、皖豆29 和皖宿2156都具有與鄭97196相近的抗大豆疫霉譜, 是優(yōu)異的大豆疫霉病抗源[42-43]。因此以標(biāo)記WZInDel11 作為分子輔助選擇工具, 即使在感病條件下也能夠有效地將這些品種的抗疫霉病基因RpsZheng或其等位基因?qū)胗N材料。另外, 中黃59 號、魯0413、徐豆1 號、早熟1 號、早熟3 號、中品12585、濟087201、吉育94、鐵豐3 號、新大粒1 號的抗性反應(yīng)型為抗病, 但是不含有標(biāo)記WZInDel11, 系譜表明這些品種與鄭97196 沒有共同的祖先或親緣關(guān)系較遠, 這些品種可能含有不同于RpsZheng的抗疫霉病基因, 值得進一步發(fā)掘和利用。

4 結(jié)論

將大豆品種鄭97196 抗疫霉病基因RpsZheng精細定位在105.2 kb 基因組區(qū)域, 開發(fā)了能夠用于抗疫霉病基因RpsZheng檢測的共分離標(biāo)記WZInDel11,鑒定了6 個含有RpsZheng或等位基因的大豆品種,研究結(jié)果為大豆疫霉病防控、進一步分子輔助選擇育種和基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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