王丹丹 柳洪鵑 王紅霞 張 鵬,* 史春余

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東泰安 271018; 2 中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心 / 植物生理生態(tài)研究所植物分子遺傳國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032

在高等植物中, 光合同化物從源器官到庫器官的長距離運(yùn)輸以蔗糖為主要形式[1]。蔗糖不僅可以作為碳源為植物生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì), 而且可以作為信號物質(zhì)參與植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[2]。在源器官中, 蔗糖以共質(zhì)體或質(zhì)外體的途徑被裝載到韌皮部細(xì)胞, 通過篩管運(yùn)輸后再以共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑卸載到庫器官中[3]。在質(zhì)外體的裝載或卸載過程中, 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose transporters or carriers, SUTs or SUCs)起重要作用[4]。

蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種典型的膜結(jié)合蛋白, 屬于MFS家族, 具有12個典型的跨膜結(jié)構(gòu)域, 存在于植物的組織或細(xì)胞中, 利用胞內(nèi)外的H+濃度對蔗糖進(jìn)行跨膜運(yùn)輸[5]。迄今為止, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、馬鈴薯、玉米等多種植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[6-9]。反義抑制PtaSUT4、StSUT4、NtSUT1的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出生長受阻, 源葉中蔗糖含量升高, 庫器官中蔗糖含量降低, 生物量下降[10-12]。AtSUC2和AtSUC4突變體的種子和幼苗對干旱、高鹽、冷脅迫和ABA 處理超敏感, 并且葉片中的蔗糖含量較高, 而根中的蔗糖含量較低[13]。目前, 關(guān)于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中于其如何介導(dǎo)蔗糖在源庫間的運(yùn)輸與分配以及如何參與逆境、糖信號的響應(yīng)。

甘薯作為以地下器官為產(chǎn)品的雙子葉作物, 其產(chǎn)量形成與光合產(chǎn)物的運(yùn)輸密切相關(guān), 因此弄清關(guān)鍵性膜蛋白的運(yùn)輸機(jī)制對提高甘薯產(chǎn)量至關(guān)重要。李巖從甘薯中分離出IbSUT1和IbSUT2, 并在酵母中驗(yàn)證其轉(zhuǎn)運(yùn)功能,免疫定位發(fā)現(xiàn)IbSUT2定位于篩管伴胞復(fù)合體; 同時發(fā)現(xiàn)IbSUT1x編碼的蛋白定位于酵母細(xì)胞膜且不具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能[14-15]。上述報道指出, 雖然甘薯蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究已取得部分進(jìn)展, 但仍有大量信息值得深入挖掘。本研究首先采用RT-PCR 結(jié)合RACE 技術(shù), 從甘薯中克隆得到IbSUT3基因, 并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用酵母突變菌株SUSY7/ura3 對其轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行驗(yàn)證;利用煙草原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析; 通過實(shí)時熒光定量PCR, 研究IbSUT3組織表達(dá)模式以及在非生物脅迫(干旱、高鹽、低溫)和外源ABA 處理下的表達(dá)特性, 研究其在脅迫處理下的響應(yīng)機(jī)制, 為深入研究IbSUT3基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 選用“泰中6 號(鑒定編號為國品鑒2013003)”為甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam.]試驗(yàn)材料。將甘薯組培苗單節(jié)點(diǎn)擴(kuò)繁后種于組培瓶中, 每瓶 3 棵,置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 16 h 光照/8 h 黑暗, 溫度25 ℃, 光照強(qiáng)度600 μmol m-2s-1, 用于脅迫處理。用于亞細(xì)胞定位的煙草為本氏煙草(Nicotiana benthamianaDomin), 種子撒播于花盆中, 待煙草生長1 個半月后, 用于原生質(zhì)體的提取。

1.1.2 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α 購自北京全式金生物有限公司。酵母菌株 SUSY7/ura3、酵母表達(dá)載體P416、GFP 表達(dá)載體PUC18 均由中國科學(xué)院植物生理研究所張鵬老師實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑 RNA 提取試劑盒RNAprep Pure plant Kit購自TIANGEN 公司(中國); SMARTer-RACE 試劑盒購自Clontech 公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 購自TOYOBO 公司; pMD18T 載體、Marker、SYBR Premix Ex Tap 熒光定量試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。脫落酸(ABA)購自Sigma 公司(美國)。

1.2 材料處理

選擇生長3 個月且長勢一致的大田甘薯植株5 株, 分別取葉片(leaf, L; 即第3 片展開葉)、葉柄(petiole, B)、莖(stem, J)、白須根(white root, WR)、發(fā)育根(developmental root, DR; 即指剛開始膨大的塊根)和成熟根(mature root,MR; 即指膨大時間較長的塊根), 用于熒光定量PCR 的測定, 研究IbSUT3基因在不同組織中的表達(dá)情況。將甘薯組培苗培養(yǎng)到株高 4 cm, 分別進(jìn)行低溫(4 ℃)、高鹽(200 mmol L-1NaCl)、干旱(300 mmol L-1Mannitol)以及脫落酸(25 μmol L-1ABA)脅迫處理, 分別于脅迫處理9、12 和24 h 取樣, 每個時間點(diǎn)取3 株植株地上部葉片, 液氮速凍。

1.3 IbSUT3 基因的克隆

從4 cm 高的組培苗取約100 mg 葉片, 液氮研磨至粉末狀, 轉(zhuǎn)至1.5 mL 離心管中, 利用試劑盒提取總RNA。根據(jù)植物SUT 基因的保守序列設(shè)計簡并引物E3-F 和E3-R(表1), 擴(kuò)增IbSUT3基因的EST 序列并測序。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計3'和5'端特異性引物(Sp-R1,2 和Sp- F1,2)(表1),參照RACE 試劑盒SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)說明書進(jìn)行IbSUT3基因的3'端和5'端擴(kuò)增并測序。序列拼接并設(shè)計擴(kuò)增全長的引物IbSUT3-F 和IbSUT3-R (表1), 以葉片cDNA 為模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 程序?yàn)?8℃預(yù)變性5 min; 98℃變性10 s, 55℃退火10 s, 72℃延伸15 s, 32 個循環(huán); 72℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 IbSUT3 基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)測序所得的氨基酸序列, 利用NCBI 的ORF Finder,參照 Kozak 法則分析該基因的開放閱讀框。采用ProtParam (http：//web.expasy.org/protparam) 分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性以及跨膜結(jié)構(gòu); DNAman 進(jìn)行氨基酸多序列比對; MEG5.2 的NJ 算法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,設(shè)bootstrap 值為1000。

1.5 qRT-PCR 分析

脅迫處理前后的樣品, 加液氮迅速研磨成粉末, 根據(jù)試劑盒的操作步驟提取組織RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA (統(tǒng)一濃度為100 ng μL-1)。運(yùn)用Primers3Plus 設(shè)計IbSUT3基因的實(shí)時熒光定量PCR 引物(表1)。以甘薯Actin為內(nèi)參基因, 每個樣品3 個平行, 3 次生物學(xué)重復(fù), 采用2-ΔΔCt方法分析試驗(yàn)結(jié)果。所用操作軟件為Bio-Rad CFX Manager,反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 1 min; 95 ℃ 15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,共39 個循環(huán); 溶解曲線, 65℃到95 ℃, 每5 s 增加0.5℃。

1.6 酵母功能驗(yàn)證

前人常使用釀酒酵母突變株SUSY7/ura3 對蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行驗(yàn)證, 該菌株只能夠利用胞內(nèi)蔗糖而不能利用胞外蔗糖, 只有在導(dǎo)入具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的外源蛋白的情況下才能在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長[16]。運(yùn)用PrimerPrimer 5.0 設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)(CalI 和SmaI)的引物SUT3m-F 和SUT3m-R (表1), 通過PCR 擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)的IbSUT3基因的開放閱讀框(ORF)區(qū)。構(gòu)建酵母表達(dá)載體 P416-IbSUT3, 轉(zhuǎn)化酵母菌株SUSY7/ura3。挑取正確表達(dá)的單克隆菌斑, 用0.9%NaCl調(diào)制OD～1, 然后稀釋成10-1、10-2、10-3和10-4, 取10 μL分別點(diǎn)于含2%蔗糖和2%葡萄糖的酵母培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為1.7 g L-1酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基YNB (Difco), 2%蔗糖(Difco)或2%葡萄糖(Difco), 5 g L-1硫酸銨, 20 mg L-1色氨酸和1.5%瓊脂糖, 用HCl 調(diào)節(jié)至pH 為5.0。30℃培養(yǎng)3 d后, 觀察菌斑生長情況。

1.7 亞細(xì)胞定位分析

運(yùn)用PrimerPrimer 5.0 設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)(SalI 和SpeI)的引物SUT3g-F 和SUT3g-R (表1), 通過PCR 擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)且不含有終止密碼子的IbSUT3基因的ORF區(qū)。構(gòu)建GFP 表達(dá)載體CaMV35S：IbSUT3-GFP (PUC18),轉(zhuǎn)化煙草葉片原生質(zhì)體。提取煙草葉片原生質(zhì)體參考Drechsel 的方法[17]; 采用PEG 介導(dǎo)法, 將GFP 融合蛋白轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體參照Abel 的方法[18]。

用配備 603/1.2 NA UPLSAPO 油鏡(Olympus)的Olympus FV1000 共聚焦掃描顯微鏡觀察煙草葉片原生質(zhì)體。通過用473 nm 激光激發(fā)并在487 nm 和521 nm 之間發(fā)射, 觀察到GFP 熒光。通過用559 nm 激光激發(fā)并在606 nm 至673 nm 之間發(fā)射, 觀察到葉綠體自發(fā)熒光。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由3 次重復(fù)試驗(yàn)獲得, 應(yīng)用DPSS 軟件分析差異顯著性, 運(yùn)用最小顯著性差數(shù)法(LSD)進(jìn)行單因素方差分析, 差異顯著性水平均為P＜0.005。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 IbSUT3 基因的獲得及序列分析

2.1.1IbSUT3基因的克隆 為了分析甘薯蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能, 本研究克隆了一個基因(GenBank 登錄號為MN233361)并命名為IbSUT3。通過簡并引物擴(kuò)增得到IbSUT3基因的EST 序列, 長度為267 bp。再根據(jù)NCBI和PrimerPrimer 5.0 軟件設(shè)計3'-RACE 和5'-RACE 的基因特異性引物, 進(jìn)行5'-DNA 和3'-DNA 克隆, 得到的片段長度分別為426 bp 和1425 bp, 拼接兩者得到IbSUT3基因的全長。根據(jù)拼接序列設(shè)計引物擴(kuò)增全長, 得到1607 bp的序列片段(圖1)。

2.1.2IbSUT3基因編碼蛋白的理化性質(zhì) ORF 大小為1518 bp, 編碼的蛋白質(zhì)有505 個氨基酸。該蛋白的分子量為53.82 kD, 等電點(diǎn)(pI)為9.19; 正電荷殘基(Asp + Glu)有31 個, 負(fù)電荷殘基(Arg + Lys)有41 個; 總的親水性平均系數(shù)為0.572, 預(yù)測IbSUT3基因編碼的蛋白為疏水性蛋白。TMHMM 軟件預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域顯示,IbSUT3基因編碼的蛋白具有12 個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)。

2.1.3IbSUT3序列比對和進(jìn)化樹分析 將IbSUT3編碼的氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsis thaliala)、煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum) 3 個代表性物種中的SUTs編碼氨基酸進(jìn)行序列多重比對(圖3)顯示,該基因編碼的蛋白與其他物種的SUTs 蛋白的氨基酸序列具有較高同源性, 保守區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)IbSUT3基因所編碼的蛋白同屬于MFS 蛋白家族, 暗示其功能的高度保守。

圖1 IbSUT3 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplified products of IbSUT3

(圖3)

為進(jìn)一步了解IbSUT3與其他物種基因之間的進(jìn)化關(guān)系, 選取不同物種的SUT 蛋白序列, 使用MEGA5.2 軟件,采用Neighbor-Joining 原理構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。分析發(fā)現(xiàn),IbSUT3編碼的蛋白屬于Group I 亞族, 并且IbSUT3、IbSUT1y、IbSUT2y、NtSUT1以及NtSUT3處在同一進(jìn)化支上, 說明它們的親緣關(guān)系較近。

2.2 IbSUT3 酵母功能驗(yàn)證

為確認(rèn)IbSUT3基因編碼的蛋白是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的功能, 構(gòu)建酵母菌株表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)化酵母。結(jié)果表明,在含有2%蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上,IbSUT3轉(zhuǎn)化的SUSY7/ura3 酵母菌株相比空載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株能更好地生長(圖5-A); 但在含有2%葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上,IbSUT3及空載體轉(zhuǎn)化的SUSY7/ura3 酵母菌株生長情況沒有差異(圖5-B)。IbSUT3的表達(dá)使SUSY7/ura3 酵母菌株能夠在蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長, 說明IbSUT3編碼了一種具有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖功能的蛋白。

圖4 IbSUT3 與其他植物SUTs 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig. 4 Phylogenetic analysis between IbSUT3 and SUTs proteins from other plants species

圖5 IbSUT3 功能分析Fig. 5 IbSUT3 function analysis

2.3 IbSUT3 蛋白亞細(xì)胞定位

為探索IbSUT3 蛋白在植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布, 構(gòu)建了IbSUT3基因的GFP 表達(dá)載體CaMV35S：：IbSUT3-GFP。將載體轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中, 借助綠色熒光蛋白信號確定目標(biāo)蛋白在原生質(zhì)體內(nèi)的分布。PEG 介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化18 h 后, 通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察顯示,轉(zhuǎn)CaMV35S-GFP 載體的煙草原生質(zhì)體內(nèi)綠色熒光分布在整個原生質(zhì)體膜、胞質(zhì)和細(xì)胞核中, 轉(zhuǎn) CaMV35S：：IbSUT3-GFP(圖6)載體的煙草原生質(zhì)體內(nèi)綠色熒光蛋白均勻分布于質(zhì)膜, 說明IbSUT3 蛋白分布于質(zhì)膜上。

圖6 IbSUT3 亞細(xì)胞定位分析Fig. 6 Analysis of IbSUT3 subcellular localization

2.4 IbSUT3 基因的表達(dá)模式分析

2.4.1IbSUT3基因在不同組織中的表達(dá) 分別提取甘薯植株不同部位的RNA 進(jìn)行qRT-PCR 檢測, 分析IbSUT3基因在不同組織中的表達(dá)模式表明,IbSUT3基因在整株植物中具有相對較高的表達(dá), 其中在L (葉片)中相對表達(dá)最高, 在J (莖)中相對表達(dá)量最低(圖7)。

圖7 IbSUT3 基因在不同組織中的表達(dá)Fig. 7 Expression of IbSUT3 in different tissues

2.4.2IbSUT3基因在非生物脅迫及外源ABA 處理下的表達(dá)模式 低溫(4 ℃)、高鹽(200 mmol L-1NaCl)、干旱(300 mmol L-1Mannitol)以及脫落酸(25 μmol L-1ABA)處理均可誘導(dǎo)IbSUT3基因的表達(dá)(圖8)。與對照處理(0 h)相比, 脅迫處理9～24 h時IbSUT3基因的表達(dá)均呈現(xiàn)上升的趨勢, 僅在干旱處理12 h 時出現(xiàn)下降趨勢, 但下降不顯著。在低溫、高鹽及干旱處理條件下, 與9 h 和24 h 相比, 處理12 h 時IbSUT3基因的表達(dá)量較低, 這可能與該取樣時間在夜間有關(guān)。

3 討論

圖8 IbSUT3 在脅迫處理下的表達(dá)模式Fig. 8 Expression profiles of IbSUT3 under stresses

由于蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物, 是植物貯藏、運(yùn)輸和利用糖分的主要形式, 其運(yùn)輸和分配的結(jié)果將直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[19], 所以分離、鑒定甘薯中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 深入了解其功能, 不僅有助于了解甘薯體內(nèi)光合產(chǎn)物的運(yùn)輸、分配過程, 而且可以分析其對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響, 進(jìn)而為實(shí)現(xiàn)甘薯高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)提供理論依據(jù)。本研究填補(bǔ)了甘薯蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的空缺, 首次成功克隆了甘薯IbSUT3基因, 該基因編碼的蛋白屬于Group I 亞族, 定位于質(zhì)膜且具有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的功能。IbSUT3基因在葉片中高表達(dá)且響應(yīng)多種脅迫處理, 暗示IbSUT3可能參與蔗糖裝載過程、參與植物抗逆反應(yīng)。

3.1 IbSUT3 具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能

SUTs 家族在植物中最典型的功能是將蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)到韌皮部中, 以實(shí)現(xiàn)光合同化物的長距離運(yùn)輸。因此對于SUTs 的研究, 首先需要分析其是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本研究從甘薯品種“泰中6 號”中克隆得到的IbSUT3基因, 其編碼的蛋白通過在缺陷酵母中進(jìn)行異源表達(dá), 發(fā)現(xiàn)可以互補(bǔ)缺陷酵母的蔗糖吸收, 說明其編碼的蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功能(圖5)。擬南芥AtSUC4和小麥的TaSUT2A、TaSUT2B和TaSUT2D等均通過此試驗(yàn)驗(yàn)證了蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[20-21]。

3.2 IbSUT3 基因在葉片中表達(dá)較高

已有研究指出Group I亞族的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要在源器官中表達(dá), 并且對蔗糖的韌皮部裝載和長距離運(yùn)輸起著非常關(guān)鍵的作用[22-24]。在反義抑制StSUT1的馬鈴薯植株中,SUT1基因的表達(dá)量下降, 植株生長遲緩, 而且在葉片中積累大量的可溶性糖和淀粉, 最終導(dǎo)致塊莖產(chǎn)量降低[22]。反義抑制NtSUT1的煙草植株表現(xiàn)出植株生長減緩, 葉片中蔗糖的輸出速率大大降低, 導(dǎo)致蔗糖在葉片中大量積累[25]。本研究發(fā)現(xiàn),IbSUT3基因編碼的蛋白屬于Group I亞族(圖4)且在源葉中高表達(dá)(圖7), 這暗示著該基因編碼的蛋白參與了蔗糖在韌皮部的裝載。源葉中的蔗糖能夠及時高效地裝載到韌皮部, 對光合產(chǎn)物從源器官到庫器官的運(yùn)輸至關(guān)重要, 對甘薯產(chǎn)量的形成意義重大。

3.3 IbSUT3 基因響應(yīng)多種非生物脅迫

Xu 等[26]通過分析 5 種雙子葉植物(Arabidopsis thaliana、Glycine max、Solanum tuberosum、Solanum lycopersicum、Populusspp.)和4 種單子葉植物(Zea mays、Oryza sativa、Triticum aestivum、Hordeum vulgare)中SUTs對逆境處理的響應(yīng)情況, 證明SUTs 在植物抵抗逆境過程中發(fā)揮重要作用。在鹽脅迫下, 所有芹菜組織中的AgSUT1基因的表達(dá)均降低, 根系中降低更為顯著, 這可能表明在鹽脅迫下根系對蔗糖代謝需求降低[27]。AtSUC2和AtSUC4在低溫、高鹽、干旱及外源ABA 處理下基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化, 且通過ABA-依賴的信號通路抵抗脅迫[13]。上述研究均證實(shí)SUTs 作為重要的調(diào)控因子參與逆境響應(yīng), 但是關(guān)于甘薯IbSUT3基因是否參與逆境響應(yīng)尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)非生物脅迫均可誘導(dǎo)IbSUT3基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化, 且在低溫、高鹽及干旱處理下的表達(dá)模式呈現(xiàn)相同規(guī)律(圖8), 這意味著IbSUT3可能以相同的機(jī)制響應(yīng)這3 種脅迫處理。IbSUT3基因在非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá), 表明該基因在甘薯抗逆中發(fā)揮重要作用。