王丹丹 柳洪鵑 王紅霞 張 鵬,* 史春余

1 山東農業(yè)大學農學院, 山東泰安 271018; 2 中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心 / 植物生理生態(tài)研究所植物分子遺傳國家重點實驗室, 上海 200032

在高等植物中, 光合同化物從源器官到庫器官的長距離運輸以蔗糖為主要形式[1]。蔗糖不僅可以作為碳源為植物生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質, 而且可以作為信號物質參與植物體內的信號轉導過程[2]。在源器官中, 蔗糖以共質體或質外體的途徑被裝載到韌皮部細胞, 通過篩管運輸后再以共質體或質外體途徑卸載到庫器官中[3]。在質外體的裝載或卸載過程中, 蔗糖轉運蛋白(sucrose transporters or carriers, SUTs or SUCs)起重要作用[4]。

蔗糖轉運蛋白是一種典型的膜結合蛋白, 屬于MFS家族, 具有12個典型的跨膜結構域, 存在于植物的組織或細胞中, 利用胞內外的H+濃度對蔗糖進行跨膜運輸[5]。迄今為止, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、馬鈴薯、玉米等多種植物蔗糖轉運蛋白基因[6-9]。反義抑制PtaSUT4、StSUT4、NtSUT1的轉基因植株表現(xiàn)出生長受阻, 源葉中蔗糖含量升高, 庫器官中蔗糖含量降低, 生物量下降[10-12]。AtSUC2和AtSUC4突變體的種子和幼苗對干旱、高鹽、冷脅迫和ABA 處理超敏感, 并且葉片中的蔗糖含量較高, 而根中的蔗糖含量較低[13]。目前, 關于蔗糖轉運蛋白的研究主要集中于其如何介導蔗糖在源庫間的運輸與分配以及如何參與逆境、糖信號的響應。

甘薯作為以地下器官為產(chǎn)品的雙子葉作物, 其產(chǎn)量形成與光合產(chǎn)物的運輸密切相關, 因此弄清關鍵性膜蛋白的運輸機制對提高甘薯產(chǎn)量至關重要。李巖從甘薯中分離出IbSUT1和IbSUT2, 并在酵母中驗證其轉運功能,免疫定位發(fā)現(xiàn)IbSUT2定位于篩管伴胞復合體; 同時發(fā)現(xiàn)IbSUT1x編碼的蛋白定位于酵母細胞膜且不具有蔗糖轉運功能[14-15]。上述報道指出, 雖然甘薯蔗糖轉運蛋白的研究已取得部分進展, 但仍有大量信息值得深入挖掘。本研究首先采用RT-PCR 結合RACE 技術, 從甘薯中克隆得到IbSUT3基因, 并對其進行生物信息學分析;利用酵母突變菌株SUSY7/ura3 對其轉運功能進行驗證;利用煙草原生質體進行亞細胞定位分析; 通過實時熒光定量PCR, 研究IbSUT3組織表達模式以及在非生物脅迫(干旱、高鹽、低溫)和外源ABA 處理下的表達特性, 研究其在脅迫處理下的響應機制, 為深入研究IbSUT3基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 選用“泰中6 號(鑒定編號為國品鑒2013003)”為甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam.]試驗材料。將甘薯組培苗單節(jié)點擴繁后種于組培瓶中, 每瓶 3 棵,置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 16 h 光照/8 h 黑暗, 溫度25 ℃, 光照強度600 μmol m-2s-1, 用于脅迫處理。用于亞細胞定位的煙草為本氏煙草(Nicotiana benthamianaDomin), 種子撒播于花盆中, 待煙草生長1 個半月后, 用于原生質體的提取。

1.1.2 菌種與質粒 大腸桿菌DH5α 購自北京全式金生物有限公司。酵母菌株 SUSY7/ura3、酵母表達載體P416、GFP 表達載體PUC18 均由中國科學院植物生理研究所張鵬老師實驗室提供。

1.1.3 試劑 RNA 提取試劑盒RNAprep Pure plant Kit購自TIANGEN 公司(中國); SMARTer-RACE 試劑盒購自Clontech 公司; 逆轉錄試劑盒 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 購自TOYOBO 公司; pMD18T 載體、Marker、SYBR Premix Ex Tap 熒光定量試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。脫落酸(ABA)購自Sigma 公司(美國)。

1.2 材料處理

選擇生長3 個月且長勢一致的大田甘薯植株5 株, 分別取葉片(leaf, L; 即第3 片展開葉)、葉柄(petiole, B)、莖(stem, J)、白須根(white root, WR)、發(fā)育根(developmental root, DR; 即指剛開始膨大的塊根)和成熟根(mature root,MR; 即指膨大時間較長的塊根), 用于熒光定量PCR 的測定, 研究IbSUT3基因在不同組織中的表達情況。將甘薯組培苗培養(yǎng)到株高 4 cm, 分別進行低溫(4 ℃)、高鹽(200 mmol L-1NaCl)、干旱(300 mmol L-1Mannitol)以及脫落酸(25 μmol L-1ABA)脅迫處理, 分別于脅迫處理9、12 和24 h 取樣, 每個時間點取3 株植株地上部葉片, 液氮速凍。

1.3 IbSUT3 基因的克隆

從4 cm 高的組培苗取約100 mg 葉片, 液氮研磨至粉末狀, 轉至1.5 mL 離心管中, 利用試劑盒提取總RNA。根據(jù)植物SUT 基因的保守序列設計簡并引物E3-F 和E3-R(表1), 擴增IbSUT3基因的EST 序列并測序。根據(jù)測序結果設計3'和5'端特異性引物(Sp-R1,2 和Sp- F1,2)(表1),參照RACE 試劑盒SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)說明書進行IbSUT3基因的3'端和5'端擴增并測序。序列拼接并設計擴增全長的引物IbSUT3-F 和IbSUT3-R (表1), 以葉片cDNA 為模版進行PCR 擴增, 程序為98℃預變性5 min; 98℃變性10 s, 55℃退火10 s, 72℃延伸15 s, 32 個循環(huán); 72℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.4 IbSUT3 基因的生物信息學分析

經(jīng)測序所得的氨基酸序列, 利用NCBI 的ORF Finder,參照 Kozak 法則分析該基因的開放閱讀框。采用ProtParam (http：//web.expasy.org/protparam) 分析蛋白質的理化性質、親疏水性以及跨膜結構; DNAman 進行氨基酸多序列比對; MEG5.2 的NJ 算法進行系統(tǒng)進化樹的構建,設bootstrap 值為1000。

1.5 qRT-PCR 分析

脅迫處理前后的樣品, 加液氮迅速研磨成粉末, 根據(jù)試劑盒的操作步驟提取組織RNA, 反轉錄為cDNA (統(tǒng)一濃度為100 ng μL-1)。運用Primers3Plus 設計IbSUT3基因的實時熒光定量PCR 引物(表1)。以甘薯Actin為內參基因, 每個樣品3 個平行, 3 次生物學重復, 采用2-ΔΔCt方法分析試驗結果。所用操作軟件為Bio-Rad CFX Manager,反應程序為95℃ 1 min; 95 ℃ 15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,共39 個循環(huán); 溶解曲線, 65℃到95 ℃, 每5 s 增加0.5℃。

1.6 酵母功能驗證

前人常使用釀酒酵母突變株SUSY7/ura3 對蔗糖轉運功能進行驗證, 該菌株只能夠利用胞內蔗糖而不能利用胞外蔗糖, 只有在導入具有蔗糖轉運功能的外源蛋白的情況下才能在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長[16]。運用PrimerPrimer 5.0 設計帶有酶切位點(CalI 和SmaI)的引物SUT3m-F 和SUT3m-R (表1), 通過PCR 擴增得到帶有酶切位點的IbSUT3基因的開放閱讀框(ORF)區(qū)。構建酵母表達載體 P416-IbSUT3, 轉化酵母菌株SUSY7/ura3。挑取正確表達的單克隆菌斑, 用0.9%NaCl調制OD～1, 然后稀釋成10-1、10-2、10-3和10-4, 取10 μL分別點于含2%蔗糖和2%葡萄糖的酵母培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配方為1.7 g L-1酵母基礎培養(yǎng)基YNB (Difco), 2%蔗糖(Difco)或2%葡萄糖(Difco), 5 g L-1硫酸銨, 20 mg L-1色氨酸和1.5%瓊脂糖, 用HCl 調節(jié)至pH 為5.0。30℃培養(yǎng)3 d后, 觀察菌斑生長情況。

1.7 亞細胞定位分析

運用PrimerPrimer 5.0 設計帶有酶切位點(SalI 和SpeI)的引物SUT3g-F 和SUT3g-R (表1), 通過PCR 擴增得到帶有酶切位點且不含有終止密碼子的IbSUT3基因的ORF區(qū)。構建GFP 表達載體CaMV35S：IbSUT3-GFP (PUC18),轉化煙草葉片原生質體。提取煙草葉片原生質體參考Drechsel 的方法[17]; 采用PEG 介導法, 將GFP 融合蛋白轉入原生質體參照Abel 的方法[18]。

用配備 603/1.2 NA UPLSAPO 油鏡(Olympus)的Olympus FV1000 共聚焦掃描顯微鏡觀察煙草葉片原生質體。通過用473 nm 激光激發(fā)并在487 nm 和521 nm 之間發(fā)射, 觀察到GFP 熒光。通過用559 nm 激光激發(fā)并在606 nm 至673 nm 之間發(fā)射, 觀察到葉綠體自發(fā)熒光。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均由3 次重復試驗獲得, 應用DPSS 軟件分析差異顯著性, 運用最小顯著性差數(shù)法(LSD)進行單因素方差分析, 差異顯著性水平均為P＜0.005。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

2 結果與分析

2.1 IbSUT3 基因的獲得及序列分析

2.1.1IbSUT3基因的克隆 為了分析甘薯蔗糖轉運蛋白的功能, 本研究克隆了一個基因(GenBank 登錄號為MN233361)并命名為IbSUT3。通過簡并引物擴增得到IbSUT3基因的EST 序列, 長度為267 bp。再根據(jù)NCBI和PrimerPrimer 5.0 軟件設計3'-RACE 和5'-RACE 的基因特異性引物, 進行5'-DNA 和3'-DNA 克隆, 得到的片段長度分別為426 bp 和1425 bp, 拼接兩者得到IbSUT3基因的全長。根據(jù)拼接序列設計引物擴增全長, 得到1607 bp的序列片段(圖1)。

2.1.2IbSUT3基因編碼蛋白的理化性質 ORF 大小為1518 bp, 編碼的蛋白質有505 個氨基酸。該蛋白的分子量為53.82 kD, 等電點(pI)為9.19; 正電荷殘基(Asp + Glu)有31 個, 負電荷殘基(Arg + Lys)有41 個; 總的親水性平均系數(shù)為0.572, 預測IbSUT3基因編碼的蛋白為疏水性蛋白。TMHMM 軟件預測蛋白跨膜結構域顯示,IbSUT3基因編碼的蛋白具有12 個跨膜結構域(圖2)。

2.1.3IbSUT3序列比對和進化樹分析 將IbSUT3編碼的氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsis thaliala)、煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum) 3 個代表性物種中的SUTs編碼氨基酸進行序列多重比對(圖3)顯示,該基因編碼的蛋白與其他物種的SUTs 蛋白的氨基酸序列具有較高同源性, 保守區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)IbSUT3基因所編碼的蛋白同屬于MFS 蛋白家族, 暗示其功能的高度保守。

圖1 IbSUT3 基因擴增結果Fig. 1 PCR amplified products of IbSUT3

(圖3)

為進一步了解IbSUT3與其他物種基因之間的進化關系, 選取不同物種的SUT 蛋白序列, 使用MEGA5.2 軟件,采用Neighbor-Joining 原理構建系統(tǒng)進化樹(圖4)。分析發(fā)現(xiàn),IbSUT3編碼的蛋白屬于Group I 亞族, 并且IbSUT3、IbSUT1y、IbSUT2y、NtSUT1以及NtSUT3處在同一進化支上, 說明它們的親緣關系較近。

2.2 IbSUT3 酵母功能驗證

為確認IbSUT3基因編碼的蛋白是否具有轉運蔗糖的功能, 構建酵母菌株表達載體, 并轉化酵母。結果表明,在含有2%蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上,IbSUT3轉化的SUSY7/ura3 酵母菌株相比空載體轉化的酵母菌株能更好地生長(圖5-A); 但在含有2%葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上,IbSUT3及空載體轉化的SUSY7/ura3 酵母菌株生長情況沒有差異(圖5-B)。IbSUT3的表達使SUSY7/ura3 酵母菌株能夠在蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長, 說明IbSUT3編碼了一種具有轉運蔗糖功能的蛋白。

圖4 IbSUT3 與其他植物SUTs 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig. 4 Phylogenetic analysis between IbSUT3 and SUTs proteins from other plants species

圖5 IbSUT3 功能分析Fig. 5 IbSUT3 function analysis

2.3 IbSUT3 蛋白亞細胞定位

為探索IbSUT3 蛋白在植物亞細胞結構中的分布, 構建了IbSUT3基因的GFP 表達載體CaMV35S：：IbSUT3-GFP。將載體轉化到煙草原生質體中, 借助綠色熒光蛋白信號確定目標蛋白在原生質體內的分布。PEG 介導原生質體轉化18 h 后, 通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察顯示,轉CaMV35S-GFP 載體的煙草原生質體內綠色熒光分布在整個原生質體膜、胞質和細胞核中, 轉 CaMV35S：：IbSUT3-GFP(圖6)載體的煙草原生質體內綠色熒光蛋白均勻分布于質膜, 說明IbSUT3 蛋白分布于質膜上。

圖6 IbSUT3 亞細胞定位分析Fig. 6 Analysis of IbSUT3 subcellular localization

2.4 IbSUT3 基因的表達模式分析

2.4.1IbSUT3基因在不同組織中的表達 分別提取甘薯植株不同部位的RNA 進行qRT-PCR 檢測, 分析IbSUT3基因在不同組織中的表達模式表明,IbSUT3基因在整株植物中具有相對較高的表達, 其中在L (葉片)中相對表達最高, 在J (莖)中相對表達量最低(圖7)。

圖7 IbSUT3 基因在不同組織中的表達Fig. 7 Expression of IbSUT3 in different tissues

2.4.2IbSUT3基因在非生物脅迫及外源ABA 處理下的表達模式 低溫(4 ℃)、高鹽(200 mmol L-1NaCl)、干旱(300 mmol L-1Mannitol)以及脫落酸(25 μmol L-1ABA)處理均可誘導IbSUT3基因的表達(圖8)。與對照處理(0 h)相比, 脅迫處理9～24 h時IbSUT3基因的表達均呈現(xiàn)上升的趨勢, 僅在干旱處理12 h 時出現(xiàn)下降趨勢, 但下降不顯著。在低溫、高鹽及干旱處理條件下, 與9 h 和24 h 相比, 處理12 h 時IbSUT3基因的表達量較低, 這可能與該取樣時間在夜間有關。

3 討論

圖8 IbSUT3 在脅迫處理下的表達模式Fig. 8 Expression profiles of IbSUT3 under stresses

由于蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物, 是植物貯藏、運輸和利用糖分的主要形式, 其運輸和分配的結果將直接影響作物的產(chǎn)量和品質[19], 所以分離、鑒定甘薯中的蔗糖轉運蛋白, 深入了解其功能, 不僅有助于了解甘薯體內光合產(chǎn)物的運輸、分配過程, 而且可以分析其對產(chǎn)量和品質的影響, 進而為實現(xiàn)甘薯高產(chǎn)優(yōu)質提供理論依據(jù)。本研究填補了甘薯蔗糖轉運蛋白研究的空缺, 首次成功克隆了甘薯IbSUT3基因, 該基因編碼的蛋白屬于Group I 亞族, 定位于質膜且具有轉運蔗糖的功能。IbSUT3基因在葉片中高表達且響應多種脅迫處理, 暗示IbSUT3可能參與蔗糖裝載過程、參與植物抗逆反應。

3.1 IbSUT3 具有蔗糖轉運功能

SUTs 家族在植物中最典型的功能是將蔗糖轉運到韌皮部中, 以實現(xiàn)光合同化物的長距離運輸。因此對于SUTs 的研究, 首先需要分析其是否具有轉運功能。本研究從甘薯品種“泰中6 號”中克隆得到的IbSUT3基因, 其編碼的蛋白通過在缺陷酵母中進行異源表達, 發(fā)現(xiàn)可以互補缺陷酵母的蔗糖吸收, 說明其編碼的蛋白具有蔗糖轉運的功能(圖5)。擬南芥AtSUC4和小麥的TaSUT2A、TaSUT2B和TaSUT2D等均通過此試驗驗證了蛋白的轉運功能[20-21]。

3.2 IbSUT3 基因在葉片中表達較高

已有研究指出Group I亞族的蔗糖轉運蛋白主要在源器官中表達, 并且對蔗糖的韌皮部裝載和長距離運輸起著非常關鍵的作用[22-24]。在反義抑制StSUT1的馬鈴薯植株中,SUT1基因的表達量下降, 植株生長遲緩, 而且在葉片中積累大量的可溶性糖和淀粉, 最終導致塊莖產(chǎn)量降低[22]。反義抑制NtSUT1的煙草植株表現(xiàn)出植株生長減緩, 葉片中蔗糖的輸出速率大大降低, 導致蔗糖在葉片中大量積累[25]。本研究發(fā)現(xiàn),IbSUT3基因編碼的蛋白屬于Group I亞族(圖4)且在源葉中高表達(圖7), 這暗示著該基因編碼的蛋白參與了蔗糖在韌皮部的裝載。源葉中的蔗糖能夠及時高效地裝載到韌皮部, 對光合產(chǎn)物從源器官到庫器官的運輸至關重要, 對甘薯產(chǎn)量的形成意義重大。

3.3 IbSUT3 基因響應多種非生物脅迫

Xu 等[26]通過分析 5 種雙子葉植物(Arabidopsis thaliana、Glycine max、Solanum tuberosum、Solanum lycopersicum、Populusspp.)和4 種單子葉植物(Zea mays、Oryza sativa、Triticum aestivum、Hordeum vulgare)中SUTs對逆境處理的響應情況, 證明SUTs 在植物抵抗逆境過程中發(fā)揮重要作用。在鹽脅迫下, 所有芹菜組織中的AgSUT1基因的表達均降低, 根系中降低更為顯著, 這可能表明在鹽脅迫下根系對蔗糖代謝需求降低[27]。AtSUC2和AtSUC4在低溫、高鹽、干旱及外源ABA 處理下基因的表達發(fā)生明顯變化, 且通過ABA-依賴的信號通路抵抗脅迫[13]。上述研究均證實SUTs 作為重要的調控因子參與逆境響應, 但是關于甘薯IbSUT3基因是否參與逆境響應尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)非生物脅迫均可誘導IbSUT3基因的表達發(fā)生顯著變化, 且在低溫、高鹽及干旱處理下的表達模式呈現(xiàn)相同規(guī)律(圖8), 這意味著IbSUT3可能以相同的機制響應這3 種脅迫處理。IbSUT3基因在非生物脅迫下的誘導表達, 表明該基因在甘薯抗逆中發(fā)揮重要作用。