李逸瀟 王利瑩 郭宇鑫 劉琴 陳楓 張濤靜

[摘要] 目的 探討糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變（DPN）大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中Toll樣受體2/4（Toll 2/4）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法 選用雄性8周齡SD大鼠80只，隨機(jī)選取14只大鼠為正常組，余66只大鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素60 mg/kg，誘導(dǎo)DPN大鼠模型，其中61只造模成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（21只）、西藥組（19只）、中藥組（21只）。中藥組灌胃糖絡(luò)寧5 g/（kg·d），西藥組灌胃α-硫辛酸20 mg/（kg·d），正常組、模型組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)給藥8周。Western blot法檢測(cè)DRG中TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 正常組大鼠TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平較弱，模型組TLR2、TLR4表達(dá)水平高于正常組（P < 0.01）;中藥組、西藥組TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平低于模型組（P < 0.05）;中藥組TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 糖絡(luò)寧可能通過(guò)抑制TLR2、TLR4蛋白表達(dá)，影響其介導(dǎo)的NF-κB等信號(hào)通路，降低炎癥及氧化應(yīng)激，減少神經(jīng)損傷。

[關(guān)鍵詞] 糖絡(luò)寧;Toll樣受體2/4;糖尿病周?chē)窠?jīng)病變;炎癥與氧化應(yīng)激

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（a）-0037-04

Effect of Tangluoning on expression of TRL2 /4 in dorsal root ganglion of rats with diabetic peripheral neuropathy

LI Yixiao1? ?WANG Liying1? ?GUO Yuxin1? ?LIU Qin1? ?CHEN Feng1? ?ZHANG Taojing2

1.The Second Clinical Medical College of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing? ?100029， China; 2.Department of Endocrinology， Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100078， China

[Abstract] Objective To investigate the regulating effect of Tangluoning on Toll-like receptors 2/4 （TLR2/4） in dorsal root ganglion （DRG） of rats with diabetic peripheral neuropathy （DPN）. Methods Eighty of eight-week-old male SD rats were selected. Fourteen rats were randomly selected as normal group， the rest of 66 rats were intraperitoneally injected with 60 mg/kg streptozotocin to induce DPN rat model， among which 61 rats were succeeded. They were divided into the model group （21 rats）， the Western medicine group （19 rats） and the Chinese medicine group （21 rats） by random number table method. Chinese medicine group was gavaged Tangluoning with 5 g/（kg·d）， the Western medicine group was gavaged α-lipoic acid with 20 mg/（kg·d）， the model group and normal group were gavaged equal amount of distilled water. The drug was administered continuously for 8 weeks. After 8 weeks， the expression of TLR2 and TLR4 proteins in DRG was detected by Western blot. Results The expression levels of TLR2 and TLR4 proteins in normal group were weak， while the expression levels of TLR2 and TLR4 proteins in the model group were higher than those in normal group （P < 0.01）. The expression levels of TLR2 and TLR4 proteins in the Chinese medicine group and the Western medicine group were lower than those in the model group （P < 0.05）. There were no statistically significant differences in the expression levels of TLR2 and TLR4 proteins between the Chinese medicine group and the Western medicine group （P > 0.05）. Conclusion Tangluoning may have impact on the signaling pathways such as the mediated NF-κB by inhibiting the expression of TLR2 and TLR4， thereby reducing inflammation and oxidative stress and reducing nerve damage.

[Key words] Tangluoning; Toll-like receptor 2/4; Diabetic peripheral neuropathy; Inflammation and oxidative stress

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是臨床常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，確診20年的糖尿病患者DPN的發(fā)病率高達(dá)90%[1]，DPN早期呈相對(duì)可逆性，但后期多發(fā)展為難治性神經(jīng)損傷，最終導(dǎo)致糖尿病足，甚至截肢，致殘率高達(dá)46.6%[2]。DPN極大地影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量，深入探究DPN的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的防治藥物對(duì)防治DPN尤為重要。

中藥復(fù)方糖絡(luò)寧，主要由黃芪、山茱萸、丹參等組成。既往研究顯示，糖絡(luò)寧對(duì)DPN具有臨床治療意義[3]。Toll樣受體（TLRs）為模式識(shí)別受體，通常被認(rèn)為是“損傷敏感”分子，是參與非特異性免疫的一類(lèi)重要蛋白質(zhì)分子[4-5]。TLRs與糖尿病及其并發(fā)癥關(guān)系密切，有研究[6-7]顯示，高血糖可上調(diào)TLR2、TLR4水平，減少胰島素分泌，加速糖尿病的發(fā)展，促進(jìn)DPN發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)擬研究糖絡(luò)寧治療DPN過(guò)程中對(duì)TLR2、TLR4的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠80只，雄性，8周齡，清潔級(jí)，體重（225±25）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[國(guó)標(biāo)GB14925-2001、大鼠SPF級(jí)屏障環(huán)境、環(huán)境安全合格證號(hào)：SYXK（京）2011-0024]，實(shí)驗(yàn)中心溫度（20±2）℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替照明。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。本研究通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

α-硫辛酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司，批號(hào)：82159-09-9）;鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Merck公司，批號(hào)：B69776）;兔抗大鼠TLR4多克隆抗體（abcam公司，貨號(hào)：ab13556）;兔抗大鼠TLR2多克隆抗體（abcam公司，貨號(hào)：ab191458）;兔抗大鼠β-actin多克隆抗體（美國(guó)CST公司，貨號(hào)：4970）;糖絡(luò)寧制劑（方藥組成：丹參、生黃芪、全蝎等，其中生藥含量約為10 g/mL，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室提供）。

1.3 主要儀器

3-30K低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）;HWS-24電熱恒溫水浴槽（上海一恒恒溫設(shè)備廠）;TS-100脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器制造公司）;SDS-PAGE電泳系統(tǒng)、170-8280型ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)BIO-Rad公司產(chǎn)品;BG-subMIDI電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）;GelDoc-It310凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司產(chǎn)品）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取66只大鼠進(jìn)行造模，腹腔單次注射STZ 60 mg/kg制作DPN大鼠模型，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為72 h后血糖值>16.7 mmol/L。最終造模成功的大鼠共61只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為中藥組21只、西藥組19只、模型組21只。中藥組灌胃糖絡(luò)寧按生藥5 g/（kg·d）;西藥組灌胃α-硫辛酸20 mg/（kg·d）;正常組、模型組灌胃等量蒸餾水[8-10]，連續(xù)灌胃8周。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食。最終有8只大鼠死亡，各組剩余大鼠數(shù)量為中藥組18只、西藥組17只、模型組18只。連續(xù)給藥8周后，根據(jù)大鼠體質(zhì)量，按350 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)劑量腹腔注射10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。迅速分離雙下肢肌肉組織，剖取兩側(cè)背根神經(jīng)節(jié)（DRG）組織，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標(biāo)

Western blot法檢測(cè)DRG中TLR2、TLR4表達(dá)。在冰浴下將DRG勻漿，抽提總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，300 mA恒流下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，加入封閉液室溫封閉1 h，加入一抗（兔抗TLR2、TLR4 1：500稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，TBST 5 min×3次洗膜后加入二抗（HRP-Goat anti Rabbit 1∶10 000稀釋?zhuān)覝胤跤?0 min，TBST 5 min×4次洗膜后暗室內(nèi)膠片曝光，采用Alpha Ease FC 4.0軟件處理系統(tǒng)將圖片上每個(gè)特異性條帶的灰度值數(shù)字化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

四組TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。正常組TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平較弱，模型組TLR2、TLR4表達(dá)水平高于正常組（P < 0.01）;中藥組、西藥組TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平低于模型組（P < 0.05）;中藥組與西藥組TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

TLR：Toll樣受體

3 討論

DPN在中醫(yī)上沒(méi)有具體的病名，但通過(guò)分析DPN的發(fā)病原因、臨床癥狀，結(jié)合中醫(yī)經(jīng)典，DPN可稱(chēng)“消渴病痹痿”，即消渴病日久入絡(luò)而導(dǎo)致的神經(jīng)并發(fā)癥。消渴病日久，氣陰兩虛。氣能行血，氣虛則血行不暢，筋脈肌肉失去血液的榮養(yǎng)逐漸出現(xiàn)手足麻木、肢體痿廢、痹痛等癥狀，故其主要病機(jī)辨證為肝腎虧虛、絡(luò)氣虛滯、絡(luò)脈瘀阻。治療上宜滋補(bǔ)肝腎、益氣活血、化瘀通絡(luò)，根據(jù)這一治則我們研制出中藥復(fù)方糖絡(luò)寧，其藥物組成主要包括丹參、生黃芪、全蝎等。前期研究顯示[3]，臨床使用糖絡(luò)寧治療DPN的有效率為89.9%，同時(shí)對(duì)DNP相關(guān)的癥狀和體征，包括麻木、疼痛、肌肉痙攣和踝反射受損等改善明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[8，11]，糖絡(luò)寧可抑制糖尿病大鼠DRG線(xiàn)粒體中超氧陰離子的產(chǎn)生，提高線(xiàn)粒體的3種抗氧化劑活性，改善線(xiàn)粒體膜電位水平;且糖絡(luò)寧能通過(guò)抑制DPN大鼠DRG組織中的絲裂原活化蛋白激酶（MAPKS）、核因子（NF）-κB信號(hào)通路，改善氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)病變[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠TLR2、TLR4都存在高表達(dá)（P < 0.01），中藥組TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平降低（P < 0.05），提示糖絡(luò)寧可有效降低DPN大鼠DRG中TLR2、TLR4蛋白表達(dá)量。

DPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，損傷會(huì)加速DPN的發(fā)生發(fā)展，TLR2、TLR4能介導(dǎo)影響炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路[13-16]。研究[6，17]發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者（T1DM）患者單核細(xì)胞表面TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平均高于正常人，同時(shí)增生的TLR2、TLR4與循環(huán)中增加的脂肪酸及內(nèi)生細(xì)胞的凋亡產(chǎn)物反應(yīng)能介導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島素分泌減少，加速高糖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)DPN的發(fā)生。有研究[18-21]顯示，TLR4及其下游信號(hào)分子在早期糖尿病誘導(dǎo)下產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏，DPN患者體內(nèi)TLR4 mRNA水平較正常升高，早期測(cè)定2型糖尿病患者（T2DM）氣血TLR4水平或可幫助診斷早期DPN。TLR2、TLR4是激活NF-κB的重要信號(hào)受體，TLR2、TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路可以通過(guò)MyD88依賴(lài)和非依賴(lài)兩種途徑誘導(dǎo)NF-κB磷酸化，激活NF-κB誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥因子如白細(xì)胞介素（ILs）、黏附因子及趨化因子等，參與炎癥應(yīng)答的調(diào)節(jié)[23-24]。本研究結(jié)果顯示，糖絡(luò)寧可使DPN大鼠TLR2、TLR4表達(dá)水平降低，且前期研究發(fā)現(xiàn)，糖絡(luò)寧的干預(yù)可減低DPN大鼠DRG NF-κB的表達(dá)水平[12]，因此推測(cè)糖絡(luò)寧可能是通過(guò)影響TLR2、TLR4蛋白表達(dá)，減少對(duì)下游NF-κB信號(hào)通路的激活，減輕炎性反應(yīng)，減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，從而達(dá)到治療作用。

綜上所述，糖絡(luò)寧可能通過(guò)抑制TLR2、TLR4表達(dá)，影響其介導(dǎo)的NF-κB等信號(hào)通路，降低炎癥與氧化應(yīng)激，減少神經(jīng)損傷。

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（收稿日期：2019-08-08? 本文編輯：劉明玉）