劉栓桃 張志剛 王立華 王榮花 李巧云 趙智中

摘要：為在大白菜種子收獲前提早鑒定雜交種純度，使新組合順利進(jìn)行品種登記、新品種種子提早上市銷售，本研究以新組合ZF006及其雙親為試材，對ZF006雜交種試配階段雙親二級側(cè)枝上近、中及遠(yuǎn)端3個(gè)部位的未成熟種子進(jìn)行了離體誘導(dǎo)和單棵幼苗DNA提取。同時(shí)，采用20對均勻分布于大白菜基因組的InDel標(biāo)記對雙親進(jìn)行多態(tài)性引物的篩選，共篩選到8對雙親間有多態(tài)性的引物，選擇其中4對共顯性且條帶清晰的InDel引物用于雜交種純度鑒定。結(jié)果表明：雙親二級側(cè)枝上不同部位的未成熟雜交種離體誘導(dǎo)萌發(fā)率有較大差異，近端和中端的種子離體誘導(dǎo)萌發(fā)率較高，遠(yuǎn)端的種子離體誘導(dǎo)萌發(fā)率較低;親本P1的二級側(cè)枝近、中及遠(yuǎn)端未成熟種子的雜交率分別是87.96%、97.45%和94.44%，而親本P2的則明顯低于P1對應(yīng)部位的種子，分別是71.53%、90.37%和90.00%，總體上， P1收獲的種子雜交率為92.49%，而親本P2的為80.52%，雙親混收的雜交率則為86.54%。綜上結(jié)果，單收和混收雜交種的純度均未達(dá)到98%的國家標(biāo)準(zhǔn)，提示新組合ZF006雙親有必要在自交不親和性方面繼續(xù)加以改進(jìn)。而本研究構(gòu)建的未成熟大白菜雜交種純度快速鑒定技術(shù)，對大白菜種業(yè)企業(yè)降低成本、加速資金周轉(zhuǎn)以及提高經(jīng)營效益具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：大白菜;雜交組合;未成熟種子;純度;分子標(biāo)記;快速鑒定

中圖分類號：S634.103.7 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號：A ?文章編號：1001-4942（2020）01-0031-06

Abstract The experiment was aimed to identify hybrid seed purity rapidly before harvest for registration of new cross combinations in time and earlier sale of new seeds. A new Chinese cabbage cross combination ZF006 and its parental lines P1 and P2 were used as materials. The in vitro seedlings were induced from parent immature seeds from near， medium and far parts of the secondary branches， and the DNA was extracted from single seedling at seed trial production stage. At the same time， 20 pairs of InDel primers were used for screening polymorphic primers between P1 and P2， and eight pairs of polymorphic primers were selected. Four of them with co-dominant property were chosen for the detection of seed purity. The results showed that the in vitro induction rate of immature seeds from different parts of the secondary side branches was different obviously， and that was 87.96%， 97.45% and 94.44% of P1 line from near-medium-far parts， while that of P2 line was 71.53%， 90.37% and 90.00% respectively. In general， the hybridized rate of seeds from P1 and P2 were 92.49% and 80.52%，respectively. If the seeds from P1 and P2 were mixed， the total hybridized rate was 86.54%. All the results implied that the hybridized rate of the hybrid seeds harvested from single parent line or mixed lines did not come up to the national standard， which was 98%. It suggested that the self-incompatibility of the parental lines should be improved. Besides， the constructed method in this study for rapid identification of immature seed purity of Chinese cabbage would have guiding significance to saving cost of Chinese cabbage seed enterprises， promoting the turnover of funds and increasing economic benefits.

Keywords Chinese cabbage; Cross combination; Immature seeds; Purity;Molecular marker; Rapid identification

大白菜是常異交作物，自交衰退嚴(yán)重，因而生產(chǎn)實(shí)踐中主要使用雜交種。山東省是大白菜雜交種主要制種基地之一，由于小氣候等原因?qū)е碌碾p親花期不遇、父母本田間移栽模式和比例等因素的差異，使得不同制種基地收獲的種子質(zhì)量存在差別，主要體現(xiàn)為父母本自交結(jié)實(shí)導(dǎo)致的自交株和異源花粉串入導(dǎo)致的假雜交種，因此，必須對雜交種的純度和真實(shí)性進(jìn)行鑒定才能包裝銷售。

常規(guī)的大白菜雜交種純度鑒定是在種子收獲后進(jìn)行，即當(dāng)年收獲的種子無論合格與否先入庫保存，待秋季通過田間種植法再進(jìn)行表型鑒定。而不同產(chǎn)地的種子入庫時(shí)必須分別存放，且不能進(jìn)行精加工，這必然增加了企業(yè)庫存管理成本。此外，為了得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果并降低售后可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，田間鑒定必須持續(xù)一個(gè)完整的大白菜生長季節(jié)，一般鑒定完成時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過當(dāng)年的銷售旺季，只能選擇將種子入庫待來年銷售，而庫存種子又占壓大量資金，增加企業(yè)的經(jīng)營成本。因此，有必要研究大白菜雜交種入庫前的純度快速鑒定技術(shù)，以最大限度降低企業(yè)經(jīng)營成本，提高資金收益比。

采用分子標(biāo)記法鑒定種子純度快速、準(zhǔn)確，不受環(huán)境限制，已經(jīng)發(fā)展成為一種比較成熟的技術(shù)，如SSR標(biāo)記[1-3]、SRAP標(biāo)記[4]、InDel標(biāo)記[5]、EST-SSR標(biāo)記[6]等已經(jīng)分別被用于不同品種大白菜雜交種的純度鑒定。上述研究中，有些研究者僅用1～2對適宜特定雜交種純度鑒定的引物開展鑒定工作[1， 3， 4]，很難鑒定種子的真實(shí)性。相比較而言，薛銀鴿[5]、楊曉云等[2]采用的InDel或SSR引物組合的形式不僅可以鑒定更多的雜交種或親本材料，也能用于雜交種真實(shí)性的鑒定，尤其是InDel引物，是典型的共顯性標(biāo)記，往往僅能鑒定出兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)[5，7]，用于雜交種純度鑒定的優(yōu)勢比較明顯。

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇20對InDel標(biāo)記，對大白菜新組合ZF006雙親P1和P2開展多態(tài)性鑒定，擬篩選適宜種子純度鑒定的特異引物，同時(shí)以制種棚中雙親單株的二級側(cè)枝不同部位未成熟種子為試材，通過成熟胚培養(yǎng)誘導(dǎo)單株幼苗提早發(fā)育、DNA快速提取等手段，對種子純度進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，以期建立快捷高效的大白菜雜交種純度鑒定技術(shù)，為提高大白菜經(jīng)營效益提供技術(shù)保障，也為其它大白菜雜交種提早鑒定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大白菜新組合ZF006及其雙親P1和P2。試驗(yàn)于2019年1—5月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所核心試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1月2日將雙親種子置于28℃恒溫培養(yǎng)箱催芽24 h，次日將露出胚根的種子點(diǎn)播于冬暖大棚的育苗缽（10 cm）中?；|(zhì)由田土和草炭按1∶ 1混勻而成。播后先覆蓋1 cm蛭石后覆蓋地膜，自然光照，幼苗自然通過春化。于3月上旬定植于制種紗網(wǎng)棚內(nèi)，雙親按1∶ 1比例間隔種植，常規(guī)管理。隨時(shí)觀察并調(diào)查雙親始花期性狀，以50%植株開始開花定位某材料的始花期，待雙親都進(jìn)入始花期后開始放入熊蜂進(jìn)行輔助授粉。

1.2.1 取樣方法 雙親取樣：從制種棚隨機(jī)選擇P1和P2各10個(gè)單株，分別取其幼嫩葉片約100 mg，錫箔紙包裹后置液氮中冷凍處理3 min以上，再于-80℃保存?zhèn)溆谩ｋs交種取樣：5月底臨近種子收獲期，分別隨機(jī)選擇P1 和P2各5株，將植株的二級側(cè)枝按照總長度平均分為三截，即如圖1所示的1、2、3，分別對應(yīng)二級側(cè)枝的近、中和遠(yuǎn)端，每段各取種莢50個(gè)備用。

1.2.2 未成熟種子處理 未成熟種子需要進(jìn)行幼胚培養(yǎng)，待其發(fā)育為具有一定組織的幼苗后再進(jìn)行DNA提取。具體操作步驟：室內(nèi)流水沖洗種莢30 min，后用0.1%升汞溶液在超凈工作臺(tái)上對種莢表面消毒10 min，無菌水洗3次，撥出幼嫩種子置于固體MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，并于25℃、16 h光照8 h黑暗條件下培養(yǎng)。每個(gè)部位幼嫩種子接種300～400粒。隨時(shí)觀察，待下胚軸伸長、子葉完全展開時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率后待用。

1.2.3 DNA的提取 取保存的P1和P2葉片以及在培養(yǎng)基上發(fā)育至子葉完全展開的單株幼苗，分別置于2 mL的研磨管內(nèi)，采用下列步驟進(jìn)行DNA提?。杭?粒直徑4 mm的陶瓷珠于研磨管中，再加200 μL TPS （100 mmol/L Tris-HCl、1 mol/L KCl和10 mmol/L EDTA，pH=8.0） 提取液，于自動(dòng)研磨儀 （法國， Precellys24） 上5 000 r/min振蕩10 s，65℃恒溫箱保溫30～60 min，待冷卻至室溫后，12 000 r/min 離心10 min;將上清液直接轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇使DNA沉淀，12 000 r/min 離心10 min，棄上清;DNA 沉淀室溫干燥10 min后，用20 μL 10 mmol/L的Tris-HCl （pH=8.0） 溶解。采用NanoDrop（美國，Thermo Fisher）超微量分光光度計(jì)測定DNA濃度，分別將P1、P2各10個(gè)單株的DNA模板等量混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應(yīng) 雜交種純度鑒定的引物從前期研究[7，8]中篩選，每條染色體上選擇2對，共計(jì)選擇20對引物（表1），委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)參照張志剛等[8]的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Mastermix 10 μL，10 μmol/L正、反向引物各1 μL，DNA 模板1 μL，滅菌水7 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸10 s，循環(huán)35 次。PCR 擴(kuò)增在BioRad T 100梯度PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，數(shù)碼相機(jī)拍照。雜交種純度=所有中選引物都是雜合帶型的種子數(shù)目/所有待檢種子數(shù)目×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親開花期調(diào)查結(jié)果

雙親花期相差時(shí)間較少： P1于4月5日前后進(jìn)入始花期， P2則延遲5 d左右，于4月10日前后進(jìn)入始花期。二者盛花期基本介于4月15日至5月15日之間。

2.2 不同部位幼嫩種子離體誘導(dǎo)結(jié)果

大白菜花序?qū)贌o限生長型，不同部位的花開放時(shí)間不一致，導(dǎo)致側(cè)枝上不同部位種莢中種子的成熟度也不一致。近端靠近主花莖，開花相對較早，種子發(fā)育時(shí)間長，臨近收獲期種子比較飽滿、接近成熟。P1和P2的近端分別接種310、289粒種子，經(jīng)過1周培養(yǎng)均能百分之百萌發(fā)，雙親間沒有差異。遠(yuǎn)端離主花莖較遠(yuǎn)，開花最晚，授粉后種子發(fā)育時(shí)間短，莢內(nèi)種子成熟度較差，基本為未成熟狀態(tài)。P1和P2的遠(yuǎn)端分別接種387、395粒種子，歷經(jīng)3周培養(yǎng)，僅分別有36、40粒種子萌發(fā)成幼苗，且幼苗長勢弱，總計(jì)萌發(fā)率僅有10%左右。中端開花時(shí)間居于上述兩者之間，莢內(nèi)種子發(fā)育時(shí)間相對較長，但由于近端到遠(yuǎn)端的花陸續(xù)開放和受粉，靠近主花莖（近端）的種莢種子發(fā)育相對較好、遠(yuǎn)離主花莖（遠(yuǎn)端）的發(fā)育相對較差。P1和P2的中端分別接種385和374粒種子，歷經(jīng)2周時(shí)間大部分未成熟種子陸續(xù)萌發(fā)，最終分別有331、313粒萌發(fā)，萌發(fā)率在85%左右。對于中端和遠(yuǎn)端不能萌發(fā)的種子，即使再延長誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間也不能促使其萌發(fā)。雙親二級側(cè)枝上各部位種子萌發(fā)情況詳見表2。

2.3 雙親間多態(tài)性引物篩選

采用20對引物對雙親進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PAGE檢測，共篩選出12對可擴(kuò)增雙親多態(tài)性條帶的引物，分別為ZF002、ZF003、ZF006、ZF007、ZF008、ZF009、ZF010、ZF013、ZF015、ZF016、ZF019和ZF020。圖2是部分引物在雙親間的篩選結(jié)果，可知，ZF007在雙親中擴(kuò)增得到的條帶數(shù)較多，不適用于雜交種純度鑒定;ZF003、ZF008等8對引物可擴(kuò)增出單一條帶，適用于雜交種純度鑒定。本研究選擇其中4對引物：ZF003、ZF008、ZF015和ZF016進(jìn)行雜交種純度鑒定。

2.4 雙親不同部位種子雜交率的分子標(biāo)記檢測

以P1、P2為對照，采用4對引物分別對3個(gè)部位的種子進(jìn)行分子標(biāo)記檢測（真雜交種判定標(biāo)準(zhǔn)：同一樣本4對引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶），部分結(jié)果見圖3。本研究中，小紗網(wǎng)棚隔離較好，所有檢測樣本中未出現(xiàn)串粉現(xiàn)象。親本P1的近、中和遠(yuǎn)端檢測到的雜交率分別是87.96%、97.45%和94.44%，親本P2相應(yīng)部位的種子雜交率分別是71.53%、90.37%和90.00%（表3）。總體上親本P1收獲的種子雜交率達(dá)92.49%，親本P2收獲的種子雜交率僅有80.52%，雙親混收的雜交率只有86.54%。

3 討論與結(jié)論

種子純度鑒定是指對一批種子中個(gè)體間在特性方面典型一致性程度的檢驗(yàn)和鑒定。種子純度是表征種子質(zhì)量的最重要指標(biāo)之一，也是種子銷售前必須進(jìn)行的檢驗(yàn)環(huán)節(jié)。大白菜通常采用自交不親和系制種，雜交種純度取決于雙親自交不親和指數(shù)的高低、制種田隔離狀況、近緣物種在制種基地周圍的分布狀況以及自身花粉與另一親本花粉同時(shí)落在柱頭上的萌發(fā)機(jī)制的差異。新的雜交組合在各項(xiàng)農(nóng)藝性狀都基本達(dá)到預(yù)定育種目標(biāo)之后、有望成為品種前，一般會(huì)進(jìn)行小規(guī)模制種，主要是為了初步了解潛在的種子產(chǎn)量，進(jìn)一步掌握雙親花期，更重要的是掌握新組合的雜交率亦即種子的純度，因?yàn)檫@是關(guān)系到一個(gè)新組合能否成為品種的重要指標(biāo)之一。

大白菜不同部位花開放時(shí)，溫度和光照條件的差異可能會(huì)影響其自交不親和性，因而本研究對新組合ZF006的雙親P1和P2上不同部位收獲的種子分別進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)不僅不同親本相同部位種子的雜交率存在顯著差異，即使同一親本不同開花時(shí)間對種子雜交率也有很大影響。前者主要是不同材料的自交親和性存在差異的緣故，而同一材料不同部位種子雜交率的差異可能與不同部位花器官開放時(shí)的環(huán)境因素有關(guān)。大白菜從始花期到末花期，歷經(jīng)仲春到初夏，溫度逐漸升高、日照逐漸延長。近端開花時(shí)間較早、環(huán)境溫度較低、日照時(shí)間較短;遠(yuǎn)端開花較晚、環(huán)境溫度較高、日照時(shí)間較長;相比較而言，中端正是盛花期，環(huán)境溫度比較適宜。這些因素都可能影響自身花粉和異緣花粉在柱頭上的發(fā)育，導(dǎo)致種子雜交率差異。劉曉東等[9]曾報(bào)道大白菜不同部位親和指數(shù)由下而上遞增的現(xiàn)象，本試驗(yàn)結(jié)果也表明兩親本收獲的種子雜交率有明顯差異，推測這種變化都同環(huán)境因素有關(guān)，并且不同材料自交親和性對自然溫度和光照的響應(yīng)不同。本研究得出，新組合ZF006的雙親P1和P2的種子總體雜交率僅有92.49%和80.52%，均未達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求的98%的純度值。因此，新組合ZF006不能作為一個(gè)品種登記，下一步需要進(jìn)一步改造雙親的自交不親和特性。

本研究建立了一種未成熟種子雜交率的分子標(biāo)記快速鑒定技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)對大白菜種子經(jīng)營企業(yè)有重要的借鑒意義。傳統(tǒng)的雜交種純度鑒定常采用田間種植法，它通過田間種植過程中觀察大白菜葉球生長發(fā)育不同階段的形態(tài)學(xué)特征對雜交種進(jìn)行鑒定，并且必須在種子收獲以后進(jìn)行。而要得到相對準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，還需要采用單粒點(diǎn)播育苗后移栽的方法，最大缺點(diǎn)是周期長、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且鑒定結(jié)果嚴(yán)重滯后，容易受環(huán)境和主觀因素的影響。采用分子標(biāo)記鑒定未成熟大白菜雜交種純度，在之前的研究中未見報(bào)道，其中比較重要的環(huán)節(jié)就是得到單粒未成熟種子的DNA。玉米、大豆、水稻等大粒種子有單粒種子DNA提取方法可供參考[10-12]，但具體到體積比較小的大白菜種子，實(shí)用性并不強(qiáng)。雖然目前有各種商業(yè)化的微量組織DNA提取試劑盒或策略可供采納，但操作一般都比較復(fù)雜、成本也比較高，不適宜在企業(yè)推廣?？紤]到簡化操作、降低成本的實(shí)踐需求，本研究采用犧牲適當(dāng)時(shí)間換取成本的策略，直接將未成熟種子進(jìn)行離體培養(yǎng)、誘導(dǎo)幼苗萌發(fā)，使其發(fā)育成具有一定細(xì)胞數(shù)目和組織重量的幼苗，再將整株幼苗用于DNA提取，常規(guī)方法就能得到滿足試驗(yàn)需要的DNA。該方法操作簡單、成本低廉、易于推廣普及。因此在大規(guī)模田間制種過程中，以未成熟雜交種為試材通過離體誘導(dǎo)幼苗萌發(fā)，再采用分子標(biāo)記方法快速鑒定雜交種純度，不僅節(jié)省田間鑒定所需的土地租賃、人工管理等費(fèi)用，還可防止不合格種子在晾曬過程中與合格種子摻雜，同時(shí)避免不同基地采收種子在倉庫中保存一年所擠占的資金和管理過程的各項(xiàng)成本，更為重要的是鑒定合格的種子晾曬后可以直接進(jìn)行包衣等精加工，可以趕在當(dāng)季提早上市銷售，這顯著加速了資金周轉(zhuǎn)率并提高企業(yè)的經(jīng)營效益。

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