艾立瑤，秦東旭，王力波，宋 英

（浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州310014）

神經退行性疾病為慢性進行性疾病，其特征在于中樞神經系統(tǒng)的感覺或認知系統(tǒng)中神經元和軸突的喪失.神經退行性疾病包括阿爾茨海默氏病（AD）、帕金森?。≒D）、亨廷頓?。℉D）、精神分裂癥和肌萎縮側索硬化癥（ALS）雖都具有不同臨床表型和遺傳病因的疾病，但都是由神經變性過程形成的[1].現(xiàn)有的針對這些疾病的藥物只能通過緩解癥狀來延緩疾病進展；然而，這些藥物不能對神經元進行治愈，也無法預防神經元的潛在退化.所以需要新的策略預防由神經炎癥和神經變性引起的進行性神經元損失.

香芹酚（CA）是在許多芳香植物中發(fā)現(xiàn)的酚類單萜，包括牛至和百里香[2].已經發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗氧化、抑菌、調節(jié)血糖、抗炎等多種生物學活性[3].進一步研究發(fā)現(xiàn) CA容易穿過血腦屏障（BBB）并調節(jié)中樞神經遞質和神經調節(jié)劑，如多巴胺[4-5].以前的研究已經證明了CA在不同動物模型中的神經保護作用，這些作用與抗氧化和抗炎作用相關[6].但是，CA在神經退行性疾病中潛在的藥理學應用需要進一步研究.本研究應用H2O2處理PC12細胞制作體外神經元損傷模型.由于PC12細胞具神經內分泌細胞的一般特征，因其具有可傳代培養(yǎng)的特點，廣泛的被作為神經元細胞模型，應用于腦缺血損傷[7]、化學性缺氧損傷[8]、神經元分化[9]以及軸突生長[10]等神經系統(tǒng)疾病、神經生理和神經藥理學的體外研究.CA已被證明在抗氧化和抗凋亡方面有較好作用，而主要研究CA對于神經細胞損傷的修復作用和對神經突生長的作用.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司）、PBS（吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司）、質量分數0.25%胰酶（吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司）、胎牛血清（碧云天）、馬血清（Gibco）、B27 添加劑（Gibco）、N2 添加劑（Gibco）、二苯基四氮哇澳鹽（MTT，Sigma）、多聚賴氨酸（PLL，Sigma）、Hoechst 33341（碧云天）等.

主要儀器：酶標儀（型號：speetramaxMZe）、垂直流超凈臺（ESCO，SCV-4A1）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific系列8000）、顯微鏡（Nikon）等.

1.2 細胞培養(yǎng)

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于質量分數10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃體積分數5%的CO2一定飽和濕度環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài).

1.2.2 神經元細胞培養(yǎng) 從新生SD乳鼠的腦中提取原代皮質神經元，皮質與大腦分離，置于預冷的Hank緩沖液中沖洗.再用質量分數0.125%胰蛋白酶-EDTA在37℃下消化組織25 min.將細胞懸浮液以1 000 r/min離心5 min.然后將細胞沉淀物首先置于含多聚賴氨酸預涂蓋玻片的培養(yǎng)基中（DMEM，質量分數10%胎牛血清、質量分數10%馬血清），并在體積分數5%的CO2濃度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).4 h時，將培養(yǎng)基更換為神經元基礎培養(yǎng)基（DMEM，質量分數10%馬血清和質量分數2%的B27），并且每2～3 d更換1次.3 d后更換阿糖胞苷培養(yǎng)基抑制神經膠質細胞生長.

1.3 PC12細胞模型的建立與觀察為了觀察H2O2對細胞的損傷情況，將PC12細胞接種于96孔板.在培養(yǎng)液中加入不同濃度的H2O2，正常對照不加H2O2，僅加入等量的培養(yǎng)液，放在37℃體積分數5%的CO2培養(yǎng)箱孵育.藥物處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察PC12細胞形態(tài)和生長情況.

1.4 細胞活性檢測

1.4.1 細胞存活率檢測 采用MTT法檢測細胞存活率.96孔板每孔加入10 μL MTT（質量濃度5 mg/mL溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）），置于37℃體積分數5%的CO2，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，待結晶完全溶解后，酶標儀測定波長490 nm處吸光值.以正常組所測的MTT吸光值為100%，損傷組及藥物處理組與正常組的比值百分比，計算存活細胞數的百分率.

1.4.2 細胞凋亡檢測 Hoechst 33342核染色用來檢測細胞凋亡率.將PC12細胞接種于24孔板上，經藥物處理后，加入Hoechst 33342，使其終體積濃度達到10 μL/mL，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照.

1.5 細胞突起長度分析PC12細胞以3×104/孔的密度接種于6孔板，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組隨機選取5張圖，應用Image J圖像分析軟件分別測量每張圖片中所有PC12突起的總長度及神經元的總數目，計算PC12細胞神經元突起的平均長度.

1.6 統(tǒng)計學分析通過均數±標注差（x±s）表示實驗數據，單因素方差分析采用 Graphpad Prism 5.0軟件進行，多組間比較Tukey檢驗.

2 結果

2.1 H2O2誘導PC12細胞損傷

2.1.1 H2O2誘導PC12細胞活力降低 用不同濃度H2O2作用于PC12，光鏡顯微鏡下觀察細胞形態(tài).顯微鏡拍照結果可見對照組細胞胞體飽滿，以長梭形為主，部分呈圓形或三角形，突起光滑粗大，交互成網狀.隨著 H2O2濃度上升，可見實驗組PC12細胞胞體大部分萎縮變圓，突起明顯變短甚至消失，細胞損傷嚴重（圖1A）.MTT法檢測細胞存活率.結果提示，與對照組相比，損傷組MTT吸光度隨H2O2濃度升高逐漸降低，證明細胞存活率隨H2O2濃度升高不斷下降（圖1B）.

2.1.2 H2O2誘導PC12細胞凋亡增加 Hoechst 33342熒光染色發(fā)現(xiàn)，空白對照組罕見凋亡小體，損傷組隨著H2O2濃度增加，凋亡小體比例逐漸增加（圖1BC）.

2.1.3 H2O2誘導PC12細胞突起減少 通過圖像軟件分析統(tǒng)計得出隨著H2O2濃度上升，細胞突起長度發(fā)生短縮（圖1E）.（A）PC12的形態(tài)學觀察.（B）MTT測定（n=3）.（C）Hoechst 33342染色.（D）PC12細胞凋亡率的分析.數據表示平均值±SD.P＜0.000 1與對照組相比.（E）PC12細胞的神經突長度分析.數據表示平均值±SD.P＜0.000 1與對照組相比.

2.2 香芹酚對H2O2誘導損傷PC12細胞的保護

2.2.1 香芹酚降低H2O2誘導損傷PC12細胞凋亡MTT法檢測細胞存活率.檢測結果顯示濃度0.01 mmol/L CA能明顯改善細胞活力，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05（圖2B），而濃度較高時對細胞生長活力有較大影響，說明CA對細胞有一定的毒性.Hoechst 33342熒光染色發(fā)現(xiàn)，空白對照組少見凋亡小體，CA給藥組（濃度0.001和0.01 mmol/L）的凋亡小體較損傷組都有較明顯的減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），而濃度0.1 mmol/L的CA凋亡小體減少趨勢較?。▓D2CD）.

2.2.2 香芹酚對H2O2誘導損傷PC12細胞突起的保護作用 顯微鏡拍照結果可見損傷組較對照組PC12細胞胞體萎縮變圓，突起明顯變短（圖2A）.測量對照組及損傷組PC12細胞突起長度，結果顯示，和對照組比較，損傷組PC12細胞突起明顯變短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）.CA組和損傷組比較，PC12細胞突起明顯延長，濃度 0.001 mmol/L CA和0.01 mmol/L CA有較明顯趨勢，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義，P＜0.000 1（圖2E）.

（A）PC12的形態(tài)學觀察.（B）MTT測定（n=3）.（C）Hoechst 33342染色.（D）PC12細胞凋亡率的分析.數據表示平均值±SD.P＜0.001，與對照組相比.P ＜0.001，與 H2O2組相比.（E）PC12細胞的神經突長度分析.數據表示平均值±SD.P＜0.000 1，與對照組相比.P＜0.000 1，與H2O2組相比.

圖1 細胞損傷檢測Fig.1 Cell damage detection

圖2 CA對PC12細胞的作用Fig.2 Effect of CA on PC12 cells

2.3 CA對神經元細胞神經突起的作用檢測結果顯示，神經生長因子（NGF）組較對照組有神經突延長趨勢，差異P＜0.01（圖3A）.另外CA組和正常組比較，神經突變長，差異P＜0.01（圖3B）.

（A）神經元的形態(tài)學觀察.（B）加入CA后一天神經元的神經突長度分析.數據表示平均值±SD.（C）加入CA后兩天神經元的神經突長度分析.數據表示平均值 ±SD.P＜0.01，與對照組相比.（D）加入CA后3 d神經元的神經突長度分析.數據表示平均值±SD.P＜0.01，與對照組相比.

圖3 CA在神經元細胞的影響Fig.3 Effect of CA on neurons

3 討論

氧化應激是由活性物質（過氧化物和氧自由基）的產生與清除之間的不平衡引起的.導致ROS大量積累，造成鈣穩(wěn)態(tài)的失調、脂類的過氧化和神經細胞的死亡[11].研究表明，阿爾茲海默癥（AD）[12]等神經退行性疾病都與氧化應激損傷有關，其特征在于中樞神經系統(tǒng)感覺或認知系統(tǒng)中神經元和軸突的喪失.PC12細胞為鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化而來的神經細胞株，與神經細胞在發(fā)生學上均來源于神經脊，在結構、功能上與神經元有很多相似之處，是一種常用的神經細胞株.而過氧化氫（H2O2）是氧化應激模型常用的損傷藥物，通過氧化應激作用可能誘導多種細胞的凋亡.本文通過H2O2損傷PC12細胞24 h建立氧化損傷模型，隨著H2O2濃度增加，細胞損傷程度逐漸加重，100 μmol/L濃度H2O2組細胞損傷較輕，而800 μmol/L濃度引起的細胞損傷較重，因此確定400 μmol/L為H2O2最適損傷濃度.隨著H2O2濃度增加，細胞凋亡率也隨之增加，細胞活力減少，細胞突起縮短.

香芹酚作為較有應用前景的臨床藥物，除了抗炎、抗氧化應激反應、抗細胞凋亡以及抗腫瘤等生物學效應[13].因其能通過血腦屏障，較多在不同動物模型的神經保護進行研究，已被證實CA具有神經保護作用.本實驗在細胞水平上設立了不同濃度CA對H2O2誘導損傷細胞的作用進行研究，發(fā)現(xiàn)濃度0.01 mmol/L的CA組對照H2O2損傷組細胞活力有明顯增強，細胞凋亡率明顯下降.另外H2O2降低了神經突長度，而在存在CA的情況下，PC12細胞可以將神經突長度恢復到一個較高的水平.證明CA可對損傷神經細胞突觸進行修復，使神經細胞突觸較損傷組有一定的延長.

神經元是神經系統(tǒng)的結構單元，神經系統(tǒng)中神經元之間通過突觸緊密聯(lián)系.突觸是將一個神經元的沖動傳到另一個神經元或另一細胞間的相互接觸的結構，包括突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜三部分.通過突觸完成神經元之間的信息傳遞與加工處理，這一過程中神經元個體也需要通過突觸來完成自我的信息反饋，所以突觸傳導對神經元活動的影響也有著重要的意義[14].神經元中的神經突向外生長是神經退行性和神經保護的標志[1].神經突生長是神經元發(fā)育，突觸形成和神經再生的重要前提.所以促進神經突的生長和神經細胞損傷后的修復在中樞神經系統(tǒng)疾病中的治療顯得尤為重要.在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)CA對經H2O2誘導的神經損傷細胞的活力增強、細胞凋亡減少、神經細胞突起增長.所以確定了CA對于神經細胞損傷后的修復作用.另外將CA作用于神經元細胞，發(fā)現(xiàn)突起較正常組有一定的延長，能夠促進神經突的生長，進一步證明了CA對神經細胞突起的增長作用.這也為香芹酚應用于神經系統(tǒng)疾病提供一定的理論基礎，為進一步臨床應用提供依據.

綜上結果表明，CA可對神經細胞起到一定的保護作用，對神經損傷具有一定的修復作用.并且CA對神經元生長發(fā)育、神經突向外生長都有一定的促進作用，因此CA應用于中樞神經系統(tǒng)疾病需要進一步研究.