付賢茂，羅國(guó)芝,2,3，劉文暢，譚洪新,2,3

(1 上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海 201306；3上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)試驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

氮循環(huán)是水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的一個(gè)重要組成部分。養(yǎng)殖活動(dòng)中，飼料等輸入的氮量占整個(gè)養(yǎng)殖系統(tǒng)總氮輸入量的90%[1]。但其中只有不到25%的氮被養(yǎng)殖對(duì)象轉(zhuǎn)化到體內(nèi)，大約有30%總氮(TN)以殘飼、糞便形式進(jìn)入池塘水體或沉積物中[2]。沉積物作為養(yǎng)殖池塘氮和其他元素的集中地，脫氮生物群落在其中扮演著重要角色[3]。沉積物不但能夠吸附水體中的氮、磷、硫等元素，調(diào)節(jié)水體水質(zhì)狀況，而且是益生菌以及底棲生物生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所。但是沉積物積累會(huì)逐漸敗壞水質(zhì)、釋放硫化氫等有毒物質(zhì)[4-5]。一般采用曬塘和挖掘方法去除沉積物和污染物，但是這種方式無(wú)法避免更深層的氮素再礦化，挖掘出來的沉積物也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[6]。因此，基于生物脫氮的原位修復(fù)方法可能更安全和更經(jīng)濟(jì)[7]。

以堿度為調(diào)控因子，研究池塘沉積物上覆水的脫氮效果和微生物群落，初步分析其脫氮規(guī)律以及微生物特性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

1.2 試驗(yàn)沉積物反應(yīng)器設(shè)置

采用12個(gè)室內(nèi)玻璃纖維反應(yīng)器(直徑30 cm，高50 cm，工作體積15 L)開展試驗(yàn)，設(shè)置A組(對(duì)照組)、B組、C組、D組，每組3個(gè)重復(fù)。每個(gè)容器接種10 cm攪拌均勻的沉積物樣品。試驗(yàn)廢水采用人工配水[13]，并通入N2使溶氧達(dá)到1.5～2.0 mg/L。為避免攪動(dòng)沉積物，使用虹吸法向每個(gè)反應(yīng)器加入2 L人工配水。反應(yīng)器用錫箔紙密封避光，試驗(yàn)用小蘇打(NaHCO3)調(diào)控堿度，各組投加量：A組0 mg/L，B組300 mg/L，C組500 mg/L，D組700 mg/L；初始?jí)A度(以CaCO3計(jì))分別為(143.3±7.10)mg/L、(275.2±22.01)mg/L、(385.1±28.01)mg/L和(466.5±61.50)mg/L。

1.3 檢測(cè)方法

R=(C1-C2)/C1×100%

(1)

總DNA提取及PCR擴(kuò)增：使用DNA提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用 Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測(cè)。以 20～30 ng DNA為模板，使用PCR引物擴(kuò)增原核生物16SrDNA上包括V3及V4的2個(gè)高度可變區(qū)。上游引物序列為(CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT)，下游引物為(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC),PCR擴(kuò)增體系(25 μL)TransStart Buffer2.5 μL，dNTPs.2 μL，primers.1 μL × 2，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板DNA 20 ng，ddH2O補(bǔ)至總體積25 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性參數(shù)94 ℃ 3 min × 1，變性參數(shù)94°C 5 sec，退火參數(shù) 57 ℃ 90 sec，延伸72 ℃ 10 s，終延伸參數(shù)72 ℃ 5 min，共進(jìn)行24個(gè)循環(huán)。

高通量測(cè)序：采用Illumina MiSeq測(cè)序系統(tǒng)對(duì)采集的底泥樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 上覆水脫氮作用的影響

表1 試驗(yàn)期間沉積物水處理效果

圖1 試驗(yàn)期間總氮(a)、氨氮(b)、亞硝酸鹽氮(c)及硝酸鹽氮(d)的動(dòng)態(tài)變化

試驗(yàn)期間堿度變化如圖2所示。A組試驗(yàn)過程中堿度維持穩(wěn)定，但是B、C和D組堿度均呈下降趨勢(shì)，最終分別降至(160.66±17.70)mg/L、(191.53±25.09)mg/L和(226.89±20.23)mg/L。

圖2 試驗(yàn)期間各組堿度動(dòng)態(tài)變化

2.2 沉積物微生物群落動(dòng)態(tài)分析

高通量測(cè)序鑒定出門水平微生物群落相對(duì)豐度如圖3所示。

圖3 初始沉積物組與試驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)菌群在門水平上的分布

初始沉積物與試驗(yàn)組系統(tǒng)中主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和Epsilonbacteraeota。其中，變形菌門(68.1%±2.95%)豐度相對(duì)較高，占主導(dǎo)地位。而經(jīng)試驗(yàn)馴化綠彎菌門與酸桿菌門相對(duì)豐度降低，分別從初始相對(duì)豐度9.48%，5.27%降低至5.7%，2.58%。硝化螺旋菌門隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加，其相對(duì)豐度也隨之增加。但試驗(yàn)組與對(duì)照組微生物群落之間無(wú)明顯差異(P>0.05)，而與初始沉積物有顯著性差異(P<0.05)，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)環(huán)境與池塘環(huán)境略有不同導(dǎo)致。

圖4所示為沉積物屬水平微生物相對(duì)豐度，其中硫桿菌(Thiobacillus)、(f__Steroidobacteraceae_Unclassified)和硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。未鑒別菌屬(Unclassified)相對(duì)豐度比例為10.77%～11.07%。其中硫桿菌(Thiobacillus)和Sulfurimonas是一類常見的自養(yǎng)型脫氮硫桿菌，主要與硫自養(yǎng)反硝化有關(guān)。值得注意的是，在試驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)了硫堿螺旋桿菌屬(Thioalkalispira)(5.6%)，其相對(duì)豐度比初始沉積物(0.4%)較高。f__Steroidobacteraceae_Unclassified(12.6%)在初始沉積物中占主要優(yōu)勢(shì)菌種，但試驗(yàn)組在馴化其相對(duì)豐度顯著下降至4.3%。

圖4 初始沉積物組與試驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)菌群在屬水平上的分布

3 討論

3.1 沉積物上覆水脫氮作用的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，不同堿度水平下，沉積物上覆水的水質(zhì)無(wú)顯著差異。水體中的TN去除效果明顯，說明沉積物對(duì)養(yǎng)殖水體中氮元素有一定的去除效果，與研究利用褐煤作為碳源對(duì)池塘沉積物中厭氧氨氧化與反硝化作用無(wú)添加碳源組的結(jié)果相似[15]，表明沉積物具有脫氮效果。

3.2 微生物群落分析

4 結(jié)論

□