徐海霞，李心紅

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院放療科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010060）

肝細胞癌（hepatocellular cancer，HCC） 是目前全球第二大癌癥死亡原因。在肝細胞癌患者中，約50%與肝炎有關(guān)肝細胞癌（HCC） 目前是全球第二大癌癥死亡原因[1-2]。MiRNA 為19-24nt 短核苷酸序列，可與多個靶序列互補結(jié)合。單核苷酸多態(tài)性（SNPs） 是遺傳多態(tài)性的常見變異，被認為是預(yù)測癌癥風(fēng)險的潛在生物標志物[3-5]。如果miRNA基因發(fā)生變異，可能會影響成熟miRNA 的質(zhì)量和數(shù)量，甚至影響到被改變的miRNA 調(diào)控的數(shù)百個靶基因。因此，miRNA 單核苷酸多態(tài)性由pri-miRNA 單核苷酸多態(tài)性和pre-miRNA 單核苷酸多態(tài)性組成，分別位于miRNA 基因500～3 000 bp 和60～70 bp 區(qū)域[6]。

到目前為止，已有報道認為miRNA 單核苷酸與胃癌、食管癌、乳腺癌和神經(jīng)母細胞瘤等多種腫瘤相關(guān)[7]。本研究對蒙古族人肝細胞癌發(fā)展中的miR-196a2 rs2910164，miR-149 rs2292832 的多態(tài)性進行了分析，以期望能夠?qū)τ诟渭毎┑念A(yù)防及診斷提供可靠的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

主要試劑：血液DNA 提取試劑盒購自天根生物公司。PCR 試劑盒購自全式金生物公司。

1.2 研究對象

蒙古族肝癌患者均來自于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)屬醫(yī)院2018年10月至2019年12月。各個盟市來內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的蒙古族80例肝細胞癌患者和蒙古族60例對照受試者是在我醫(yī)院進行體檢后隨機選擇。每一名受試者均簽署書面知情同意書。所有工作均在護士的幫助下完成。

1.3 方法

1.3.1 血液DNA 的提取DNA 的提取按試劑盒說明書操作。簡單來說就是，取200 μL 的血液，加入200 μL的緩沖液肯20 μL的蛋白酶K，56℃消化10 min，期間混勻數(shù)次，直至溶液變清亮。室溫靜置3 min 然后加入350 μL的BD 緩沖液，混勻，倒入吸附柱CG2 中，13 400 g 離心30s，倒掉收集管中的液體。再加入500 μL的緩沖液GDB，13 400 g離心30 s 倒掉收集管中的液體。加入600 μL的漂洗液，13 400 g 離心30 s 倒掉收集管中的液體，重復(fù)此步驟，然后加入100 μL的洗脫液，13 400 g 離心2 min，收集液體保存。

1.2.2 基因檢測引物序列（表1）：所有引物由上海生工程合成。

表2 酶切位點Tab.2 Restriction sites

然后進行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)過程為，95℃5 min，（95 ℃30 s，56 ℃30 s，72℃30 s） 35個循環(huán)，72 ℃40 min，4℃保存。

1.2.3 基因分析根據(jù)不同酶切位點進行酶切分析，所有酶切均在37℃下進行。酶切后進行電泳。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計分析均由SPSS 軟件完成。絕對變量表示為頻率和百分比。分別通過雙尾studentt檢驗和χ2檢驗對連續(xù)變量與絕對變量間的不同進行分析。顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

SNP 位點均采用PCR 產(chǎn)物酶切，依據(jù)電泳圖可得到（圖1） miR-196a2 rs11614913，CC 為202 bp，CT 為202 bp+50 bp，TT 為50 bp。miR-149 rs2292832，CC 為135bp，CT 為135 bp+40 bp，TT為40 bp。

本研究的肝細胞癌患者和對照受試者登記錄入。肝細胞癌和對照受試者年齡、性別吻合度的P值（0.66 和1.00） 均大于0.05。

對 照 組 miR-196a2 rs11614913，miR-149 rs2292832 的基因型分布符合哈迪-溫伯格平衡定律，人口的抽樣合格。miR-196a2 rs11614913 的TT 基因型和T 等位基因與CC 基因型相比，肝細胞癌危險性分別增加了2.26 倍和1.50 倍，見表3。

miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性和肝細胞癌危險性之間的關(guān)系沒有受到年齡、性別，飲酒與否，居住地區(qū)，腫瘤大小等影響，見表4。

圖1 miR-196a 和miR-149SNP 酶切電泳圖Fig.1 miR-196a and miR-149SNP digestion electrophoresis

表3 miR-146a rs2910164,miR-149 rs2292832 多態(tài)性與肝細胞癌危險性之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between miR-146a rs2910164,miR-149 rs2292832 polymorphism and the risk of hepatocellular carcinoma

表4 人口統(tǒng)計及臨床特征Tab.4 Demographics and clinical characteristics

3 討論

肝癌是世界上第二常見的惡性腫瘤，據(jù)估計每年有782 500例新發(fā)病例和745 500例死亡病例報告，其中50%以上來自中國[2，8]。miRNA 在真核生物中保存良好，被認為是基因調(diào)控的重要組成部分[9-11]。新的研究表明miRNA 參與了多種生物學(xué)過程，包括發(fā)育、分化、細胞生長和凋亡[10，12]。本研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌危險性增加與miR-196a2 rs11614913 的TT 基因型和T 等位基因有明顯的相關(guān)性[7，13]。有報道稱，肝癌患者中miR-196a2（rs11614913） 基因型的頻率有顯著差異[6]。據(jù)報道，miR-196a2 基因型分布與正常對照組相比有顯著性差異（C ＞T）；發(fā)現(xiàn)miR-196a2cc 基因型和C等位基因在中國人肝癌發(fā)病中有重要作用，尤其是在 HBV 感染患者中研究表明 miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性可以作為肝細胞癌的診斷標記[8，14-16]。有 較 多 研 究 發(fā) 現(xiàn)miR-196a2 rs11614913的多態(tài)性與幾種癌癥，如胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和腎癌的危險性顯著相關(guān)，但是結(jié)果不太一致[3]。miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性與胃癌危險性不相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a2 rs11614913 影響肺癌的易感性[6]。在印度人中做了研究，多元統(tǒng)計分析顯示miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性使絕經(jīng)后的婦女乳腺癌危險性增加了3.2 倍[4]。本研究為臨床診斷蒙古族肝癌的診斷奠定基礎(chǔ)。