李秀玲，董旭東，顏 芳，陳醇侯，晴 沙，劉煥玲

（云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，云南昆明 650032）

非綜合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip and/or cleft palate，NSCL/P） 是人類最常見(jiàn)的出生缺陷之一，約占唇腭裂的50%～70%，是無(wú)其他系統(tǒng)器官畸形、不屬于任何綜合征范圍之內(nèi)的唇裂伴或不伴腭裂和單純性腭裂的總稱。NSCL/P 的發(fā)病原因非常復(fù)雜，迄今普遍歸因于易感基因和環(huán)境因素協(xié)同作用，是一種多基因遺傳疾病。NSCL/P 發(fā)生率因區(qū)域、民族和人種各有不同差別極大，全球發(fā)病率為1/700[1-2]，其中發(fā)病率最高的是亞洲，為1/500；發(fā)病率最低的是非洲，為1/2 500；歐洲的白種人則介于兩者之間。國(guó)內(nèi)NSCL/P患病率多達(dá)1.42/1 000[3-4]，總發(fā)生率占我國(guó)出生缺陷的14.0%。因此，探索NSCL/P 的發(fā)病原因，做到提前預(yù)防，減低嬰幼兒出生缺陷率，對(duì)進(jìn)一步提高人口素質(zhì)極為重要。

NSCL/P 是目前遺傳疾病的研究熱點(diǎn)之一，被人們發(fā)現(xiàn)的候選基因和易感位點(diǎn)越來(lái)越多，C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的易感位點(diǎn)，其位于2p21 染色體內(nèi)[5]，在下頜骨、上顎和鼻咽區(qū)的發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，提示C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)的突變可能與NSCL/P的發(fā)病有關(guān)。筆者過(guò)對(duì)云南漢族人群NSCL/P 患兒rs6740960 位點(diǎn)基因型進(jìn)行檢測(cè)及分析，以探討C2orf91 基因上rs6740960 位點(diǎn)多態(tài)性與非綜合征唇腭裂的相關(guān)性。本研究在國(guó)內(nèi)屬首次報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2015年9月至2019年9月期間在云南省第一人民醫(yī)院就診的孕婦，其中非綜合征性唇腭裂胎兒148例作為病例組。入選胎兒染色體結(jié)果正常，排除其他先天性疾病。排除孕婦吸煙、酗酒、葉酸不足及有毒有害物質(zhì)接觸史。隨機(jī)選取180例新生兒作為控制組。所有檢測(cè)對(duì)象均排除先天性畸形。本研究課題獲得了所有研究對(duì)象父母的知情同意，并通過(guò)了云南省第一人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審查。兩組研究對(duì)象均為云南漢族人群。

1.2 標(biāo)本采集與保存

病例組胎兒采集羊水、臍血或者引產(chǎn)組織，對(duì)照組新生兒收集新鮮臍帶血，均立即置于-20℃冰箱中，隨后轉(zhuǎn)至-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 提取

采用全血DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，試劑盒購(gòu)自昆明碩擎生物科技有限公司。

1.4 PCR 擴(kuò)增

設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)orward primer：5'-CCAGCGCTCTGG ATGTCATTA-3'，Reverse primer：5'-CCTGGTCGT GGGAAACTCTG-3'。PCR 總反應(yīng)體系為25 μL，包括：10X ThermoPol or Standard Taq Reaction Buffer 2.5 μL；10 mM dNTPs 0.5 μL；10 μM Forward Primer 0.5 μL；10 μM Reverse Primer 0.5 μL；Template DNA 500 ng；Taq DNA Polymerase* 0.125 μL；加Nuclease-free water 至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，PCR 循環(huán)條件為：95℃變性20 s，57℃退火30 s，68℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.5 Sanger 測(cè)序

使用能在DNA 模板鏈上互補(bǔ)摻入?yún)s不能延伸的四種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP） 與正常的四種脫氧核苷三磷酸（dNTP） 競(jìng)爭(zhēng)，合成的互補(bǔ)鏈可以在任何位置終止，獲得長(zhǎng)短不一的反應(yīng)產(chǎn)物，通過(guò)電泳分離，從四條泳道上的條帶順序就能讀出DNA 的序列。此技術(shù)又被稱為第一代測(cè)序技術(shù)[6]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)輸入SPSS 軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)病例組與對(duì)照組人群等位基因和基因型分布完成Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)，評(píng)估所選樣本是不是具備代表性。采用Pearson χ2test 對(duì)兩組基因型以及等位基因頻率相比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)的基因型測(cè)序結(jié)果

病例組和對(duì)照組野生純合子TT 基因型共檢出315例，突變雜合子AT 基因型共13例，兩組突變純合子AA 基因型均未查出（從負(fù)鏈方向測(cè)序，見(jiàn)圖1、圖2）。

圖2 突變雜合子AT 基因型Fig.2 Mutant heterozygote genotype AT

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

病例組和對(duì)照組等位基因和基因型實(shí)際值和預(yù)期值的分布與Hardy-Weinberg 平衡定律相一致（P＞0.05），說(shuō)明樣本具備代表性。

兩組等位基因分布的Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)結(jié)果：病例組χ2=0.146（P=0.703），對(duì)照組χ2=0.091（P=0.763），結(jié)果表明兩組的等位基因分布合與Hardy-Weinberg 平衡定律相符（P＞0.05），見(jiàn)表1。

兩組基因型分布的Hardy-Weinberg 平衡分析結(jié)果：病例組χ2=0.203（P=0.903），對(duì)照組χ2=0.175（P=0.916），結(jié)果得出兩組人群的基因型分布與Hardy-Weinberg 平衡定律相一致（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3 等位基因和基因型頻率的χ2 檢驗(yàn)

病例組野生純合子TT 基因型檢出143例，突變雜合子AT 基因型檢出5例，對(duì)照組野生純合子TT 基因型檢出172例，突變雜合子AT 基因型檢出8例，兩組突變純合子AA 基因型均未查出。經(jīng)Pearsonχ2檢驗(yàn)，χ2=0.042（P=0.837），兩組的C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)等位基因頻率分布沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表3；經(jīng)Pearson χ2檢驗(yàn)，P=0.779，兩組的C2orf91 基因rs6740960基因型頻率分布在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表1 病例組和對(duì)照組等位基因Hardy-Weinberg 平衡分析Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test of allele distribution in the case group and control group

表2 病例組和對(duì)照組基因型Hardy-Weinberg 平衡分析Tab.2 Hardy-Weinberg equilibrium test of genotype distribution in the case group and control group

表3 病例組和對(duì)照組C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)的等位基因頻率（n）Tab.3 Allele frequency of rs6740960 locus of c2orf91 gene between the case group and control group （n）

表4 病例組和對(duì)照組C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)的基因型頻率（n）Tab.4 Genotype frequency of c2orf91 rs6740960 locus between the case group and control group （n）

3 討論

人類基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association studies，GWAS） 研究發(fā)現(xiàn)與唇腭裂遺傳相關(guān)的候選基因有VAX1、WNT3、MSX1、MAFB、EPHA3、THADA、ABCA4、MTHFR、IRF6、ZNF-533、SUMO1、MSX1、FOXE1、CRISPLD2 等20 多個(gè)[7-14]，并且不斷有GWAS 報(bào)道新的易感位點(diǎn)有rs6740960、rs4901118、rs3746101、rs28689146 等[15-20]。其中位于C2orf91 基因的rs6740960 位點(diǎn)，屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA 的基因[18]，在下頜骨、上顎和鼻咽區(qū)的發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，其突變會(huì)影響面部形態(tài)特征的發(fā)育。Ludwig 等[5]證明了在人類神經(jīng)嵴細(xì)胞（hNCC） 和小鼠胚胎顱面組織中活躍的基因組區(qū)域rs6740960 位點(diǎn)高表達(dá)；Karlijne Indencleef[18]等研究發(fā)現(xiàn)C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)T→A 的突變會(huì)明顯影響胎兒下頜骨的發(fā)育（P＜0.05）。

本研究中對(duì)非綜合征性唇腭裂病例組和對(duì)照組等位基因和基因型分布分別進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組的等位基因和基因型分布與哈倫平衡定律相符合，說(shuō)明了本研究所選群體具備代表性。對(duì)病例組與對(duì)照組研究對(duì)象的等位基因頻率和基因型頻率分布進(jìn)行相關(guān)性研究顯示：兩組的等位基因和基因型頻率均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)分析差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明云南漢族人群中C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的發(fā)生無(wú)相關(guān)性。

由于NSCL/P 具有遺傳異質(zhì)性，即使同一個(gè)位點(diǎn)，不同地域、民族或種族，研究結(jié)論有可能不同。云南是一個(gè)少數(shù)民族聚居的地方，民族具有多樣性，為了避免民族帶來(lái)的差異性，所以只選取云南漢族人群。NSCL/P 作為多因素交互作用的疾病，本研究中只考慮了C2orf91 基因一個(gè)常見(jiàn)多態(tài)性位點(diǎn)與NSCL/P 的關(guān)系，有一定的局限性，在以后的研究中我們應(yīng)當(dāng)運(yùn)用表觀遺傳學(xué)、基因表達(dá)和流行病學(xué)，從不同角度、不同層面探索NSCL/P 的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)本研究病例數(shù)量不夠大，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)功效較低，是造成陰性結(jié)果的原因之一，因此判斷rs6740960 是否為NSCL/P 的相關(guān)位點(diǎn)，需要加大樣本量進(jìn)行篩查及驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示C2orf91 基因rs6740960 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與云南漢族人群NSCL/P 的發(fā)生沒(méi)有相關(guān)性，但鑒于C2orf91 基因rs6740960 多態(tài)性位點(diǎn)與NSCL/P 發(fā)病關(guān)系在國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道，仍需要對(duì)其進(jìn)一步探討。C2orf91 作為一個(gè)新的易感基因，對(duì)該基因的研究還比較淺顯，還只處在基因位點(diǎn)與NSCL/P 關(guān)系的研究上，本研究可為以后對(duì)該基因突變與唇腭裂發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。