劉 沖，曹 慧，楊彩彩，王 震

（榆林市第一醫(yī)院骨科二病區(qū)，陜西榆林 719000）

骨缺損可能是意外、感染和許多其他情況引起的疾病，小骨缺損會自行愈合，而大骨缺損會因為自體的修復(fù)機制難以修復(fù)超過骨再生臨界值而無法自行修復(fù)[1]。骨移植是臨界尺寸骨缺損的主要治療方法，自體骨移植是骨移植的黃金標準，但由于無法獲得足夠數(shù)量的自體移植物，在需要進行大量填充和移植的患者中并不合適；異種移植雖然可以克服這些缺點，但這些替代物的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力低[2]，因此，研究骨誘導(dǎo)和傳導(dǎo)能力有利于骨缺損后的修復(fù)治療。

柚皮苷（Naringin，NAR） 是骨碎補的主要有效成分，屬于多甲氧基黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎及促進骨形成等作用[3]。有研究表明，柚皮苷可通過調(diào)控miRNAs 表達水平發(fā)揮其作用，例如，柚皮苷可通過上調(diào)miR-20a 的表達水平促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化[4]。據(jù)報道，miRNAs 在多種疾病中異常表達，調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、細胞周期等生物過程[5]，例如，miR-199a-5p 可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕神經(jīng)細胞凋亡和炎癥[6]；miR-199a-5p 可通過靶向Mafb 蛋白正向調(diào)控RANKL 誘導(dǎo)破骨細胞分化[7]，但其在骨損傷修復(fù)中研究較少。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶-1（ECE1）作為miR-199a-5p 的靶基因是一種強有力的血管收縮劑，其表達與更大、更強壯、更致密的骨骼的存在有關(guān)[8]。因此，本研究旨在探討柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸對骨損傷修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MC3T3-E1 細胞（貨號：CBP60946） 購買于南京佰科生物科技有限公司，柚皮苷購買于上海吉至生化科技有限公司，CO2培養(yǎng)箱購買于上海冠森生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將凍存的MC3T3-E1 細胞從液氮罐中取出，置于37℃水浴鍋中，不停搖晃至完全溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入新鮮的含胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打混勻后置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，向各孔加入不同濃度柚皮苷（5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后檢測不同濃度柚皮苷對細胞增殖的影響。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染取處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞，用胰蛋白酶消化后，將細胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將 si-ECE1、miR-199a-5p mimics/inhibitor 轉(zhuǎn)染于MC3T3-E1 細胞中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 待用。

1.2.3 Western blotting 檢測MC3T3-E1 細胞中蛋白表達水平MC3T3-E1 細胞經(jīng)相應(yīng)的處理后，用預(yù)冷PBS 輕輕洗滌3 次，冰上用Western 蛋白裂解液裂解15 min，12 000 r/mim 離心20 min 收集上清；用BCA 法測蛋白含量，每組用等量蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳分離，200 mA 恒定電流電轉(zhuǎn)90 min 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉孵育2 h 后加入一抗（1:1 500），4℃孵育過夜，然后用過氧化物酶結(jié)合的二抗（1:1 000）。使用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，于凝膠成像儀上觀察拍照，采用Image J 灰度分析軟件分析灰度值，計算蛋白相對表達水平。

1.2.4 MTT 檢測MC3T3-E1 細胞增殖活力收集處于對數(shù)生長期的待測細胞，以1×105個/ 孔的密度接種于48 孔板，每孔0.5 mL，將細胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別在培養(yǎng)一定時間時加入50 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，1 000 r/min 離心10 min，小心吸去上清，每孔加入300 μL二甲基亞砜，吹打均勻后，每孔取200 μL液體移入新的96 孔板，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定在490 nm 處的吸光值。

1.2.5 RT-qPCR 檢測miRNAs 表達使用Trizol試劑盒提取細胞中的總RNA，在提取過程中注意避免RNA 降解和污染。采用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將全部RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6 為內(nèi)參，進行PCR 擴增，擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共50個循環(huán)。引物序列見表1，結(jié)果采用2-△△Ct表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-199a-5p 和ECE1 靶向關(guān)系StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-199a-5p 和ECE1 的結(jié)合位點。采用基因突變技術(shù)改變miR-199a-5p 和ECE1 的結(jié)合位點或擴增ECE1 3’-UTR 片段，分別插入熒光素酶報告基因PmirGLO 中，產(chǎn)生ECE1 基因突變型MUT-PmirGLO-ECE1-3’ -UTR 和 野 生 型WT-PmirGLO-ECE1-3’ -UTR。將 miR-199a-5p mimics 或陰性對照分別與WT-PmirGLO-ECE1-3’-UTR 和MUT-PmirGLO-ECE1-3’-UTR 共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1 細胞中，培養(yǎng)48 h，用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.7 MC3T3-E1 細胞ALP 活性檢測取各組待測細胞，用胰蛋白酶消化后，將細胞以1×105個/孔的密度接種于24 孔板，每孔0.5 mL。培養(yǎng)14 d用PBS 洗滌3 次，加入RIPA 蛋白裂解液，反復(fù)凍融裂解細胞，然后加入ALP 檢測試劑孵育30 min后再加入3 M NaOH 終止反應(yīng)，酶標儀檢測490 nm吸光度值（OD 值）。

1.2.8 茜素紅染色檢測MC3T3-E1 細胞礦化情況取各組待測細胞，胰蛋白酶常規(guī)消化后將細胞以1×105個/孔的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)14 d 用PBS 洗滌3 次，4%戊二醛溶液固定30 min，2%茜素紅染色30 min，PBS 洗滌3 次后光鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有試驗均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計圖采用GraphPad 7.0 軟件進行繪制。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷促進骨損傷修復(fù)

MTT 檢測結(jié)果顯示，用不同濃度柚皮苷（5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL） 處 理MC3T3-E1 細胞后，顯著促進細胞增殖活力（P＜0.001），且在20 ng/mL 時細胞增殖活力最強（圖1A，P＜0.01）。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，柚皮苷（20 ng/mL）能顯著促進Runx2、OPN、BMPs、OC 表達（圖1B，P＜0.01，P＜0.001）。MC3T3-E1 細胞ALP 活性檢測結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著促進MC3T3-E1 細胞ALP 活性（圖1C，P＜0.01）。茜紅素染色檢測結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著促進MC3T3-E1 細胞的鈣礦化（圖1D，P＜0.01）。由此可知，柚皮苷能促進MC3T3-E1 細胞增殖和成骨分化和鈣礦化，以此促進骨損傷修復(fù)。

圖1 柚皮苷對骨損傷修復(fù)的影響Fig.1 Effects of naringin on bone injury repair

2.2 柚皮苷上調(diào)MC3T3-E1 細胞中miR-199a-5p 表達

RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著上調(diào)與骨損傷修復(fù)相關(guān)miRNAs 的表達水平，尤其是miR-199a-5p 的表達水平（圖2，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。由此可知，柚皮苷能上調(diào)MC3T3-E1 細胞中miR-199a-5p 表達水平。

圖2 柚皮苷對MC3T3-E1 細胞中與骨損傷修復(fù)相關(guān)miRNAs 的表達的影響Fig.2 Effects of naringin on the expression of miRNAs related to bone injury repair in MC3T3-E1cells

2.3 miR-199a-5p 靶向下調(diào)ECE1 表達

通過生物學(xué)信息庫 StarBase 2.0 預(yù)測miR-199a-5p 的靶基因，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)ECE1 是miR-199a-5p 的候選靶基因（圖3A）。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，過表達miR-199a-5p 能使ECE1 野生型載體的熒光素酶活性顯著降低，而對ECE1 突變型載體的熒光素酶活性無顯著影響（圖3B，P＜0.01）。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic 后ECE1 的表達顯著降低；柚皮苷也可顯著降低MC3T3-E1 細胞中ECE1的表達（圖3C，P＜ 0.01）。由此可知，miR-199a-5p 可靶向下調(diào)ECE1 的表達。

2.4 柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸促進骨損傷修復(fù)

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，敲降ECE1后，MC3T3-E1 細胞中ECE1 表達顯著下調(diào)，而同時敲降ECE1 和miR-199a-5p 后回復(fù)單獨敲降ECE1 對ECE1 表達的抑制作用（圖4A，P＜0.001）。MTT、ALP 活性檢測、茜素紅染色檢測結(jié)果顯示，柚皮苷顯著促進MC3T3-E1 細胞增殖活力、ALP 活性和鈣礦化能力；敲降miR-199a-5p后回復(fù)柚皮苷對MC3T3-E1 細胞增殖活力、ALP活性和鈣礦化的促進作用，且與NC 組無顯著差異；敲降ECE1 后顯著促進了柚皮苷對MC3T3-E1細胞增殖活力、ALP 活性和生物礦化能力的促進作用；同時敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷對MC3T3-E1 細胞增殖活力、ALP 活性和鈣礦化能力的促進作用比單獨敲降miR-199a-5p 顯著增加，比單獨敲降ECE1 顯著降低（圖4B）。Western blotting 檢 測MC3T3-E1 細 胞 中Runx2、OPN、BMPs、OC 表達水平，檢測結(jié)果顯示，柚皮苷顯著促進Runx2、OPN、BMPs、OC 表達水平；敲降miR-199a-5p 后回復(fù)柚皮苷對Runx2、OPN、BMPs、OC 表達的促進作用；敲降ECE1 后顯著上調(diào)了柚皮苷對Runx2、OPN、BMPs、OC 表達的促進作用；同時敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷對Runx2、OPN、BMPs、OC 表達的促進作用比單獨敲降miR-199a-5p 顯著增加，比單獨敲降ECE1 顯著降低（圖4C，P＜0.01，P＜0.001）。ALP 活性檢測、茜素紅染色檢測結(jié)果顯示，柚皮苷顯著促進ALP 活性和鈣礦化能力；敲降miR-199a-5p 后回復(fù)柚皮苷對ALP 活性和鈣礦化的促進作用，且與NC 組無顯著差異；敲降ECE1后顯著促進了柚皮苷對ALP 活性和生物礦化能力的促進作用；同時敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷對ALP 活性和鈣礦化能力的促進作用比單獨敲降miR-199a-5p 顯著增加，比單獨敲降ECE1顯著降低（圖4D、4E，P＜0.01）。由此可知，柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸促進骨損傷修復(fù)。

圖3 miR-199a-5p 對ECE1 表達的影響Fig.3 Effects of miR-199a-5p on ECE1 expression

3 討論

隨著人類生產(chǎn)、生活節(jié)奏的加快以及人口老齡化的加劇，骨和軟骨損傷的患者呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[9]。研究表明，骨損傷后的修復(fù)是一個特殊的過程，產(chǎn)生新骨的一系列有序過程受到系統(tǒng)和局部因子的調(diào)控，任何影響該過程的因素出現(xiàn)異常都會影響愈合的進程[10]，因此，明確這些事件過程和調(diào)節(jié)因素對促進骨愈合有重要意義。

圖4 柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸促進骨損傷修復(fù)Fig.4 Naringin promotes the repair of bone injury by regulating the axis of miR-199a-5p/ECE1

有研究發(fā)現(xiàn)，NAR 具有雌激素活性，可以降低血液膽固醇，減少血栓形成，改善局部微循環(huán)和營養(yǎng)供應(yīng)，因此，NAR 被廣泛應(yīng)用于臨床，預(yù)防心腦血管疾病，并作為骨折愈合的輔助治療手段[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NAR 可通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs） 的表達促進成骨細胞的增殖和分化，使骨密度增加，促進骨形成[12]。此外，NAR 還可將地塞米松導(dǎo)致的MC3T3-E1 細胞骨橋蛋白和骨保護素蛋白表達減少及堿性磷酸酶的活性減退逆轉(zhuǎn)改善，并增加他們的骨礦物質(zhì)密度，表現(xiàn)出較好的成骨作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可促進MC3T3-E1 細胞增殖，促進MC3T3-E1 細胞中促進成骨分化相關(guān)基因（Runx2、OPN、Collagen-Ⅰ、OC、BMP） 的表達，增加成骨細胞ALP 活性并促成骨細胞進生物礦化，從而促進骨損傷修復(fù)。

眾所周知，miRNA 在多種疾病中異常表達，可通過與靶mRNA 結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白表達，進而影響細胞生物學(xué)過程。據(jù)報道，有許多中藥的活性提取物都可通過介導(dǎo)細胞中miRNAs 表達調(diào)控細胞生物學(xué)過程。例如，淫羊藿活性提取物淫羊藿苷可通過抑制股骨頭微血管內(nèi)皮細胞中miR-335 的表達來預(yù)防激素性股骨頭壞死的發(fā)生[14]；骨碎補提取物柚皮苷可通過增加miR-126 的表達下調(diào)VCAM-1 抑制人軟骨肉瘤的遷移和侵襲能力[15]。有研究表明，miR-199a-5p 在多種疾病中均起著重要的調(diào)控作用，例如，miR-199a-5p 通過靶向下調(diào)MAP3K11表達抑制非小細胞肺癌的惡性生物學(xué)進程[16]；過表達miR-199a-5p 抑制細胞存活和血管生成，而抑制miR-199a-5p 在肺微血管內(nèi)皮細胞中的表達可促進細胞增殖和血管生成[17]；miR-199a-5p 可通過抑制HIF1α-Twist 途徑促進成骨[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可上調(diào)MC3T3-E1 細胞中miR-199a-5p 表達，促進骨損傷修復(fù)。

內(nèi)皮素（endothelin，ET） 是高度有效的血管收縮肽，參與多種人體生理、病理過程，通常以極低的濃度存在于機體中，當刺激作用于內(nèi)皮細胞時，ET 會裂解成無活性的多肽，再在ECE1 的剪切作用下轉(zhuǎn)化成活性多肽，以此發(fā)揮其作用[19]。ECE1 是一種Ⅱ型膜邊界金屬蛋白酶，在細胞表面以二聚體的形式存在，ECE1 的大胞外結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浯呋钚云鹬匾饔?。先前的研究表明，增強的ECE1 活性增加了ET 的合成，促進了血管平滑肌細胞的增殖和有絲分裂，活性氧的產(chǎn)生和炎癥分子的形成，導(dǎo)致血壓升高和動脈粥樣硬化[20]。此外，ECE1 還參與了一系列疾病的發(fā)病機制，包括骨髓缺血/再灌注誘導(dǎo)的損傷、癌癥、腦出血和骨質(zhì)疏松、骨折[21-24]等，但其在骨損傷修復(fù)中的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p 靶向下調(diào)ECE1 表達，促進骨損傷修復(fù)。

綜上所述,柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1分子軸促進MC3T3-E1 細胞增殖、成骨分化和礦化，從而可促進骨損傷修復(fù)。

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