李 嬌，李 江，付 鵬，彭 霜，阮志國，侯安國，柯 瑾

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500）

柴胡來源于傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense，DC.） 或 狹 葉 柴 胡 （Bupleurum scorzonerifolium Willd.） 的干燥根，為常用中藥品種，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功，臨床主要用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來、肝郁氣滯、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明柴胡皂苷具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱、抗腫瘤、增強免疫、保肝利膽、降血脂等作用[2]。柴胡主含皂苷、黃酮、多糖、揮發(fā)油等化學(xué)成分，其中皂苷類成分是其主要活性物質(zhì)[3]，現(xiàn)行版《中國藥典》將柴胡皂苷a、d 的總量作為質(zhì)控指標(biāo)。

目前柴胡皂苷的提取主要采用醇提法和水提法，醇提提取率相對較高，但成本也高，且后續(xù)操作繁瑣，水提操作簡單，但提取率低[4]。表面活性劑對于物質(zhì)的溶出有一定的增溶作用，其在人參皂苷、苦瓜皂苷、無患子果皮皂苷、薯蕷皂苷[5-9]等成分的提取中已有報道，但未見使用表面活性劑輔助提取柴胡皂苷的文獻研究，故本文采用表面活性劑強化提取柴胡中的柴胡皂苷，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝，旨在提高以水作溶劑時柴胡皂苷的提取率。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

柴胡皂苷a 對照品（批號：110777-201711），柴胡皂苷d 對照品（批號：110778-201711） 均購自中國食品藥品檢定研究院；柴胡，云南昆明百草園藥材經(jīng)營部；乙腈，色譜純；十二烷基硫酸鈉、泊洛沙姆188、吐溫-80℃、甲醇、95%乙醇、正丁醇，均為分析純。

Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；BT25S 電子分析天平（d=0.000 01 g），上海精密儀器儀表有限公司；CP124C 電子天平（d=0.000 1 g），奧豪斯儀器（常州） 有限公司；SHZ-D（Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；DFY-500 搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；HDM-3000 恒溫電熱套，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件[10]色譜柱Agilent Zorbax C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：水-乙腈，洗脫梯度見表1；流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；進樣量10 μL。對照品及樣品色譜圖見圖1。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取柴胡皂苷a、d 對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成每mL 含柴胡皂苷a 0.56 mg，柴胡皂苷d 0.54 mg 的混合對照品溶液。分別精密吸取柴胡皂苷a、d 混合對照品溶液適量用甲醇稀釋成不同濃度的溶液，其中柴胡皂苷a 濃度為0.11 mg/mL、0.17 mg/mL、0.28 mg/mL、0.56 mg/mL、0.84 mg/mL、1.13 mg/mL，柴胡皂d濃 度 為0.11 mg/mL、0.16 mg/mL、0.27 mg/mL、0.54 mg/mL、0.80 mg/mL、1.07 mg/mL。按“1.3.1”項下色譜條件分別進樣，測定峰面積，以峰面積值（Y） 為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷a、d 濃度（X） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程，柴胡皂苷a 的回歸方程為Y=1 737.5X-1.084 5（r=0.999 9），柴胡皂苷d 的回歸方程為Y=2 354.8X-9.794 8（r=0.999 9），表明柴胡皂苷a 在1.125～11.25 μg范圍內(nèi)，柴胡皂苷d 在1.07～10.7 μg 范圍與峰面積間有良好的線性關(guān)系。

表1 流動相洗脫梯度Tab.1 Mobile phase elution gradients

圖1 對照品、樣品HPLC 圖Fig.1 HPLC of reference substances and samples

1.2.3 供試品溶液的制備及柴胡皂苷提取率的測定將柴胡粉碎過40 目篩后精密稱取粉末20 g，按一定比例加入表面活性劑水溶液，加熱回流提取一定時間，放冷，離心，取上清液轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，搖勻，備用。精密吸取柴胡提取液10 mL 用水飽和的正丁醇萃取5 次，每次10 mL，合并萃取液，回收溶劑，殘渣用甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，進樣，測定，計算柴胡皂苷a、d 總量。

1.2.4 單因素試驗按照“1.2.3”項下方法，加熱回流提取，其他條件固定不變，分別考察表面活性劑種類、提取時間、加液量、表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)對柴胡皂苷提取率的影響，分別確定各因素的最佳水平。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝在單因素的基礎(chǔ)上，選取SDS 濃度（A）、提取時間（B）、加液量（C）、提取次數(shù)（D） 為變量，以柴胡皂苷a、d 總含量（Y） 為響應(yīng)值，通過Box-Behnken 原理，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝。因素與水平見表3，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 表面活性劑種類對柴胡皂苷提取率的影響[11]稱取柴胡粉末20 g，分別加入10 倍量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的不同表面活性劑水溶液，回流提取30 min。選取的表面活性劑為Tween 80、Poloxamer 188、SDS[12]，以純水介質(zhì)中的柴胡皂苷提取率為對照，實驗結(jié)果見表2。

由表2 可知，三種表面活性劑對柴胡皂苷提取均有強化作用，其中強化效果最好的表面活性劑是SDS，在此條件下，柴胡皂苷提取率高達8.34 mg/g，為純水提取率的6.2 倍，因此確定表面活性劑種類為SDS。

表2 表面活性劑對柴胡皂苷提取率的影響Tab.2 Effects of different surfactants on the extraction yield of saikosaponins

2.1.2 提取時間對柴胡皂苷提取率的影響稱取柴胡粉末20 g，加入10 倍量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS水溶液，加熱回流提取條件下，考察不同提取時間對柴胡皂苷提取率的影響，見圖2。

由圖2 可知，柴胡皂苷提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)提取時間為50 min 時，柴胡皂苷提取率最高，達到9.30 mg/g，60 min 時含量下降，可能與柴胡皂苷開始水解有關(guān)。故選擇提取時間為50 min。

圖2 提取時間對提取率的影響Fig.2 The effect of extraction time on extraction rate

2.1.3 加液量對柴胡皂苷提取率的影響稱取柴胡粉末20 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS 水溶液，加熱回流提取50 min，考察不同加液量對柴胡皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，在加液量為4～10 倍范圍內(nèi)時，柴胡皂苷提取率逐漸升高，繼續(xù)增加溶劑用量，提取率增加很少，因此選擇加液量為10 倍。

圖3 加液量對提取率的影響Fig.3 The effect of liquid addition on extraction rate

2.1.4 SDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對柴胡皂苷提取率的影響稱取柴胡粉末20 g，分別加入10 倍量不同濃度的SDS 水溶液，加熱回流提取50 min，考察不同濃度的SDS 水溶液對柴胡皂苷提取率的影響，見圖4。由圖4 可以看出，隨著SDS 濃度的增大，柴胡皂苷提取率也隨之增加，當(dāng)濃度達1.25%時，提取效果最好，濃度達1.5%時，提取率反而下降。因此選擇SDS 濃度為1.25%。

圖4 SDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.4 The effect of SDS quality fraction on extraction rate

2.1.5 提取次數(shù)對柴胡皂苷提取率的影響稱取柴胡粉末20 g 加入10 倍量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%的SDS 水溶液，加熱回流提取50 min，考察不同提取次數(shù)對柴胡皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5 可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，柴胡皂苷提取率略有增加，其中提取3 次和提取2 次的提取率接近。因此，從生產(chǎn)實際考慮提取次數(shù)選擇2 次即可。

綜上所述，單因素最佳參數(shù)水平分別為：1.25%SDS、加液量10 倍、提取時間50 min、提取次數(shù)2 次。

圖5 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.5 The effect of extraction times on extraction rate

2.2 響應(yīng)面法工藝優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計在單因素的基礎(chǔ)上，選取SDS濃度（A）、提取時間（B）、加液量（C）、提取次數(shù)（D） 為變量，以柴胡皂苷a、d 總含量（Y） 為響應(yīng)值，通過Design-Expert.V 8.0.6 軟件[13]，采用四因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝因素與水平表見表3，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗采用Design-Expert8.0.6 軟件對柴胡提取工藝各因素進行回歸擬合，得回歸方程Y ＝12.50+0.1A+0.22B+0.31C+1.33D-0.14AB+0.41AC-0.017AD-0.29BC+0.34BD-0.48CD-0.78A2-0.91B2-0.31C2-1.35D2。對該數(shù)學(xué)模型進行方差分析和顯著性檢驗，見表5。由表5 可知，模型的決定系數(shù)R2=0.9125，P＜0.000 1 說明模型具有較高的顯著性，且失擬項P=0.903 3，失擬項不顯著，說明回歸方程擬合度良好[13-14]。各因素對柴胡皂苷a、d 總含量的影響為：提取次數(shù)＞加液量＞提取時間＞SDS 濃度，D 因素對響應(yīng)值的影響極顯著[15-16]。二次項A2、B2、D2 對柴胡皂苷a、d 總含量的影響顯著，說明各因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面分析采用Design-Expert 8.0.6 軟件，根據(jù)擬合模型繪制柴胡中柴胡皂苷含量響應(yīng)面的響應(yīng)面圖（圖6） 與等高線圖（圖7），可得到各參數(shù)范圍內(nèi)的極值及因素間相互作用對響應(yīng)值的影響。

2.2.4 最佳工藝與驗證試驗通過Design-Expert 8.0.6 軟件預(yù)測分析得到最佳提取工藝條件為：SDS濃度1.28%，提取時間52.09 min，加液量10.16倍，提取2.50 次。為方便操作將最優(yōu)工藝調(diào)整為：SDS 濃度1.28%，提取時間52.09 min，加液量10.16 倍，提取2.0 次。按此條件進行3 次平行試驗驗證，求平均值，所得結(jié)果（12.82 mg/g） 與模擬值（12.87 mg/g） 相差不大（SD=0.05%），說明響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

表3 響應(yīng)面因素水平表Tab.3 The response surface factor levels

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.4 The test design and results of response surface

表5 回歸模型的方差分析Tab.5 Analyses of variance of regression models

圖6 各因素交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surfaces of various factors'interaction

3 討論

柴胡作為傳統(tǒng)常用中藥，在我國已有2000 余年的應(yīng)用歷史，其主要含有柴胡皂苷、揮發(fā)油、多糖、黃酮、甾醇等成分。柴胡皂苷類作為柴胡的主要活性成分，屬于三萜皂苷類化合物，常用的提取方法為溶劑提取法，目前文獻報道多以乙醇-水、堿性試劑-乙醇-水、水作為提取溶劑，而提取效果差異較大，尤其以水作為提取溶劑，柴胡皂苷的溶出度最低[17-19]。柴胡皂苷a 結(jié)構(gòu)中含有環(huán)氧醚環(huán)，該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在提取過程中容易開裂造成結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致提取液中柴胡皂苷a 的含量降低[20]，但堿性溶劑作為提取溶劑時對該過程有抑制作用。然而，在實際生產(chǎn)過程中，柴胡通常是和其他藥材一同提取，采用堿性乙醇作為溶媒，雖然可以提高柴胡皂苷a 提取率，但堿性環(huán)境對其他成分可能造成影響，故多以中性溶劑進行提取，如中性50%乙醇[18]。

表面活性劑含雙親結(jié)構(gòu)，能使溶液的表面張力顯著降低，對物料具有界面吸附和分散作用，可以增強溶劑對物料的潤濕性和滲透性，從而增加提取率、降低提取時間及成本，在輔助提取植物的活性成分方面應(yīng)用廣泛[21]。本研究考慮加入表面活性劑，以增加柴胡皂苷的溶出，提高柴胡皂苷的提取率。

Box-Behnken 響應(yīng)曲面分析法相對于正交試驗設(shè)計具有預(yù)測性好、精確度高的特點，本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡的提取工藝，可連續(xù)對整個區(qū)域的各水平進行分析，極大程度優(yōu)化了柴胡的提取工藝。柴胡在中醫(yī)臨床使用的主要形式是湯劑，而水作為提取溶媒，顯示出對柴胡皂苷較低的提取率，加入十二烷基硫酸鈉，同時采用響應(yīng)面法確定了最佳提取工藝，增加了柴胡的提取率，為柴胡皂苷提取提供了一定的參考。

本研究中加入了表面活性劑，雖然增加了柴胡皂苷的提取率，但是在進行含量測定時發(fā)現(xiàn)，與未加表面活性劑的相比，表面活性劑會對柴胡皂苷a、d 的分離度造成影響，導(dǎo)致分離度減小，甚至造成分離度無法符合分析要求。因此在供試品制備過程中可采用萃取的方法。但萃取時十二烷基硫酸鈉與正丁醇會造成分層不明顯，所以采用離心法，4 000 r/min 離心10 min，以除去十二烷基硫酸鈉對實驗的干擾。