吳樂艷，侯雯清，孫孔春，楊璨瑜，舒 紋，沈報春

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500）

神經(jīng)酸（Nervonic acid） 因最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動物的神經(jīng)組織中而得名，其在周圍神經(jīng)組織和腦組織中含量較高，是神經(jīng)組織中生物膜的重要組成成分，也是大腦發(fā)育及維持正常功能所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，對神經(jīng)介質(zhì)和受體發(fā)揮作用具有重要的意義[1]。有研究表明，神經(jīng)酸具有增強體液免疫和細胞免疫[2]、改善記憶、認知功能損傷保護和抗氧化[3]作用，能疏通受損大腦神經(jīng)通路并可促進神經(jīng)細胞再生[4]。此外，神經(jīng)酸對帕金森病[5-6]、腦白質(zhì)疏松癥[7-8]、Zellweger 綜合征[9]、多發(fā)性硬化癥[10]、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良[11]、腦血管疾病[12-13]等有一定的治療和預(yù)防作用。神經(jīng)酸被認為是21 世紀最有前途的腦健康保健品和藥品，為預(yù)防和治療腦部疾病提供了一條新途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。

目前，神經(jīng)酸定量分析多采用衍生化氣相色譜法[15-18]，該方法是將神經(jīng)酸酯化后測定酯化物的含量，前處理過程較繁瑣，且可能存在未反應(yīng)的神經(jīng)酸，導(dǎo)致神經(jīng)酸含量測定不準(zhǔn)確。文獻[19]采用了高效液相色譜法測定蒜頭果油分離出的神經(jīng)酸含量，本文將建立一種反相高效液相色譜方法直接測定神經(jīng)酸的含量，該方法不需對樣品進行酯化，可直接進樣分析，流動相組成簡單，分析時間短，定量準(zhǔn)確，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)樣品的快速分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀（包含島津SPD-M10A 檢測器，島津LC solution 色譜工作站）；超純水機（Direct-Q 3 UV）：美國Millipore 公司；電子天平（BS224S）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超聲清洗儀（SK3200H）：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品：由云南盈木佳生物科技有限公司提供（純度99.0%）；神經(jīng)酸片劑：某公司生產(chǎn)；乙腈（色譜純）：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；磷酸（分析純）。實驗用水為超純水（電阻率?8.2 MΩ·cm，25℃）。

1.2 色譜分析條件

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品0.050 4 g，以乙腈為溶劑，配制濃度約為2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密量取神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 至10 mL 容量瓶中，加入9 mL 乙腈定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；再按照濃度梯度稀釋法分別配制濃度為0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL 的多份標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 待測樣品溶液配制

取神經(jīng)酸片劑10 片，精密稱定，研細。精密稱取適量，置10 mL 容量瓶中，加乙腈適量，超聲處理使主成分溶解，乙腈定容至刻度，充分搖勻，得待測樣品溶液，備用。

1.5 測定

將標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品溶液先用0.22 μm 的有機系濾膜過濾，取續(xù)濾液以10 μL 的進樣量上樣于高效液相色譜儀，記錄保留時間、峰面積等參數(shù)。按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計算，即可測得神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸的含量。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取神經(jīng)酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，照“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，以各份標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（X，mg/mL） 為橫坐標(biāo)，以神經(jīng)酸色譜峰的峰面積（Y） 為縱坐標(biāo)作圖（見圖1），得線性回歸方程y＝3 000 000 X（mg/mL）+4 795.9，R2＝0.999 9。神經(jīng)酸含量在0 .01～0.2 mg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（P=0.000）。

2.1.2 精密度實驗精密吸取2 mg/mL 神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 μL，照“1.2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果見表1。峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.80%，說明實驗方法精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗精密吸取待測樣品溶液10 μL，照“1.2.1”項下色譜條件，在24 h 內(nèi)測定6次（0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h），記錄峰面積，結(jié)果見表1。由表1可見，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.52%，待測樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 加樣回收率照“1.2.1”項下色譜條件，首先測定待測樣品溶液中神經(jīng)酸的峰面積，帶入“2.1.1”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測樣品溶液的濃度。接著將待測樣品溶液平均分成9 份，再分成3 組，每組分別添加相當(dāng)于待測樣品溶液中神經(jīng)酸含量80%、100%、120%三個水平的神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后照“1.2.1”項下色譜條件分析，結(jié)果見表2。由表2 可見，添加神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后所得樣品的回收率在96.94%～104.46%之間，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在0.81%～3.80%之間，平均回收率為101.53%。該方法準(zhǔn)確度良好，可用于神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸的定量分析。

2.2 樣品含量測定

圖1 神經(jīng)酸線性回歸方程Fig.1 Linear regression equation of nervonic acid

表1 精密度實驗、穩(wěn)定性實驗結(jié)果（1）Tab.1 Precision and stability results （1）

表1 精密度實驗、穩(wěn)定性實驗結(jié)果（2）Tab.1 Precision and stability results （2）

表2 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Spiked recoveries and RSDs results

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品典型色譜圖Fig.2 Representative chromatograms of standard and sample

按照“1.2.3”項下方法，分別精密稱取約相當(dāng)于神經(jīng)酸10 mg 的片粉，制備兩份神經(jīng)酸樣品溶液，采用建立的高效液相色譜方法測定兩份樣品溶液中神經(jīng)酸的含量，典型色譜圖見圖2，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果Tab.3 Analytical results for the sample

3 討論

神經(jīng)酸不僅可以修復(fù)受損的神經(jīng)纖維，而且還可促進受損的神經(jīng)細胞再生，對動脈粥樣硬化、高血脂、腦梗塞、腦出血、腦萎縮、癡呆、小兒腦癱、癲癇、帕金森病、腦外傷等疾病的防治有一定作用。國外對神經(jīng)酸的研究已開展了將近一個世紀，但在我國尚處于起步階段，對于其來源、獲取方法、藥理作用、生理作用及新劑型、應(yīng)用等的研究還有很大空間。

本課題組在前期實驗中曾采用現(xiàn)有報道的衍生化氣相色譜法測定神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸含量，先將樣品進行脂肪酸甲酯化，再用有機溶劑進行提取，氣相色譜法測定，外標(biāo)法定量。實驗過程中發(fā)現(xiàn)由于神經(jīng)酸沸點較高，采用將神經(jīng)酸進行甲酯化后再定量的方法，可能存在神經(jīng)酸甲酯化不完全的問題；甲酯化后又經(jīng)過正己烷提取的操作，整個含量測定過程前處理操作步驟較多，會存在神經(jīng)酸損失導(dǎo)致測定值比真實值偏小、定量不準(zhǔn)確的問題，提取回收率較低；前處理過程復(fù)雜也存在方法的重復(fù)性及可操作性不強等缺陷?；诖?，筆者建立了一種直接測定樣品中神經(jīng)酸含量的反相高效液相色譜方法，提高了神經(jīng)酸定量的準(zhǔn)確度。

本研究建立的含量測定方法，首次采用C8柱，神經(jīng)酸出峰時間大概在20 min，具有分析時間短，分析效率高等優(yōu)點[20]，實現(xiàn)了對神經(jīng)酸片劑中神經(jīng)酸含量的準(zhǔn)確測定，該方法不需要進行衍生化，前處理過程簡單易操作，分析條件溫和，分析速度快，定量結(jié)果準(zhǔn)確。此外，該方法的色譜條件、流動相組成簡單，精密度、重復(fù)性及RSD符合相關(guān)規(guī)定，穩(wěn)定性好，靈敏度高，選擇性好。可實現(xiàn)人力、物力、財力的節(jié)省，有利于神經(jīng)酸資源的開發(fā)及運用，具有較好的應(yīng)用前景。