于 鵬，王奕文，段寶鑫，薛友林，谷學(xué)軍*

(1遼寧大學(xué) 稀散元素化學(xué)研究所，遼寧 沈陽110036；2遼寧大學(xué) 輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

硒是人體所需的必不可少的稀有元素，研究證明硒具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等功能[1，2].多糖是一種至少有10種單糖通過糖苷鍵連接而成的多聚糖[3，4].將硒與多糖有機(jī)結(jié)合后形成硒多糖，其抗氧化、抗腫瘤的效果會(huì)更好.在分離純化硒多糖的過程中，甘薯內(nèi)棕色色素會(huì)加深硒多糖溶液體系的顏色，污染纖維素陰離子交換柱的填料；甘薯內(nèi)存在大量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)會(huì)掛在陰離子交換層析柱的填料上，影響硒多糖的純化，所以應(yīng)盡可能脫除甘薯粗硒多糖內(nèi)的蛋白質(zhì)[5].

傳統(tǒng)的Sevag法是使用氯仿和正丁醇協(xié)同作用達(dá)到脫蛋白的效果[6]，此方法所使用的化學(xué)試劑對(duì)環(huán)境有一定的污染.而聚酰胺對(duì)環(huán)境無污染并可重復(fù)使用，所以本實(shí)驗(yàn)使用聚酰胺為填料的柱層析方法脫除色素和蛋白質(zhì)，使用單因素考察法探究脫色和脫蛋白的工藝參數(shù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：甘薯(sweet potato)由華實(shí)生態(tài)實(shí)驗(yàn)基地以1 mg/mL的亞硒酸鈉自主人工生物施硒法培育而成.

主要試劑：無水乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、重蒸苯酚、濃硫酸、牛血清蛋白、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、聚酰胺.

主要儀器：真空冷凍干燥機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中壓玻璃層析柱(25 mm×600 mm).

1.2 粗多糖的提取

自主培育的富硒甘薯→清洗干凈→切成薄片→鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干→粉碎機(jī)粉碎→過60目篩→石油醚回流脫脂→抽濾→浸提3 h→離心浸提液30 min→收集上清液→濃縮至原體積的1/5→乙醇沉淀(保證體系乙醇濃度為75%)→離心醇沉液30 min→收集沉淀→丙酮和無水乙醇反復(fù)洗滌三次→復(fù)溶→蒸餾水回流透析48 h→真空冷凍干燥→甘薯粗硒多糖.

1.3 粗硒多糖的脫色與脫蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

工藝流程：復(fù)溶后的粗硒多糖→加入到聚酰胺層析柱中→調(diào)節(jié)流速→自動(dòng)部分收集器收集過濾后的樣品→濃縮；

本實(shí)驗(yàn)最佳上樣量的確定：分別取5份甘薯粗硒多糖溶液，固定上樣體積為75 mL，上樣量為150、300、450、600、750 mg，吸附時(shí)間為30 min，洗脫速率為3 mL/min；最佳上樣體積的確定：分別取3份甘薯粗硒多糖溶液，固定上樣量為600 mg，上樣體積分別為60、75、90 mL，吸附時(shí)間為30 min，洗脫速率為3 mL/min；最佳吸附時(shí)間的確定：分別取5份甘薯粗硒多糖溶液，固定上樣量為600 mg，上樣體積為75 mL，吸附時(shí)間分別為5、10、20、30、60 min，洗脫速率為3 mL/min.最佳洗脫速率的確定：分別取5份甘薯粗硒多糖溶液，固定上樣量為600 mg，上體積為75 mL，吸附時(shí)間為30 min，洗脫速率分別為1.5、3、4.5、6、9 mL/min.

1.4 脫色率的檢測

取甘薯粗硒多糖樣品復(fù)溶后，與紫外分光光度計(jì)在200～800 nm進(jìn)行全波長掃描，在可見光區(qū)選擇最大吸收峰的波長即為檢測波長.計(jì)算公式為：脫色率(%)=(脫色前的吸光度-脫色后的吸光度)/脫色前的吸光度×100%.

1.5 多糖保留率的檢測

采用苯酚-硫酸法測脫色脫蛋白前后的總糖含量，苯酚-硫酸法的具體步驟如下：取固體苯酚5 g于棕色容量瓶內(nèi)，定容至100 mL后水浴加熱，使苯酚充分溶解，配成5%的苯酚，放到4 ℃恒溫內(nèi)保存.精確稱取5 mg充分烘干后的分析純D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品定容至50 mL配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，并存放于4 ℃的環(huán)境內(nèi)保存.吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于相應(yīng)的具塞試管中，用超純水補(bǔ)齊至0.5 mL，依次分別加入0.5 mL 5%的苯酚，然后迅速加入2.5 mL 98%的濃硫酸，40 ℃水浴30 min后放置室溫.在490 nm處測吸光度，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.利用公式y(tǒng)=10.56x+0.011 2計(jì)算總糖含量，多糖保留率(%)=脫蛋白后的多糖含量/脫蛋白前的多糖含量×100%.

1.6 蛋白質(zhì)脫除率的檢測

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定甘薯粗硒多糖的蛋白質(zhì)含量，考馬斯亮藍(lán)G-250法的具體方法如下：精確稱取考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)品100 mg溶于50 mL 95%的乙醇中，隨后加入100 mL 85%的磷酸，最后用蒸餾水稀釋至1 000 mL，配成0.01%的考馬斯亮藍(lán)試劑并在4 ℃下存于棕色瓶中備用.精確稱取標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白10 mg并定容至100 mL的容量瓶內(nèi)，配置0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液并存放于4 ℃的環(huán)境內(nèi)備用.分別精確吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，分別加入蒸餾水，將體系補(bǔ)齊至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL混勻，放置10 min，并于595 nm處測其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線，如圖2所示.利用公式y(tǒng)=5.205x+0.099 3測蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)的脫除率(%)=(脫蛋白前的吸光度-脫蛋白后的吸光度)/脫蛋白前的吸光度×100%.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線

2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 上樣量的影響

根據(jù)圖3分析得知，當(dāng)固定上樣體積為75 mL，吸附平衡時(shí)間為30 min，洗脫速率為3 mL/min時(shí)，伴隨著上樣量逐漸增加的同時(shí)，總糖保留率呈遞增趨勢，而脫色率和脫蛋白呈微小遞減趨勢.理想效果是總糖保留率高而脫色和脫蛋白率也高.綜上因素，選擇甘薯硒多糖的上樣量為600 mg.

2.2 上樣體積的影響

根據(jù)圖4分析得知，當(dāng)固定上樣量為600 mg，洗脫時(shí)間為30 min，吸附平衡速率為3 mL/min時(shí)，隨著上樣體積的不斷升高，脫色率、脫蛋白率和總糖保留率沒有顯著的變化，上樣體積大會(huì)增加含糖具塞試管的數(shù)量，同時(shí)會(huì)增加后期濃縮操作的誤差.綜上因素，選擇甘薯硒多糖的上樣體積為60 mL(2/5倍柱體積).

圖3 上樣量的影響

圖4 上樣體積的影響

2.3 吸附平衡時(shí)間的影響

根據(jù)圖5分析得知，當(dāng)固定上樣量為600 mg、上樣體積為75 mL、洗脫速率為3 mL/min時(shí)，隨著吸附平衡時(shí)間的增加，總糖保留率在5～20 min區(qū)間內(nèi)呈遞減趨勢，而脫色率和脫蛋白率在5～20 min內(nèi)呈遞增趨勢，20 min以后，總糖保留率、脫色率、脫蛋白率均沒有顯著的變化.為確?？偺潜Ａ袈?、脫色率和脫蛋白率高，綜上因素，選擇甘薯硒多糖的吸附平衡時(shí)間為20 min.

2.4 洗脫速率的影響

根據(jù)圖6分析得知，當(dāng)固定上樣量為600 mg、上樣體積為75 mL、吸附平衡時(shí)間為30 min時(shí)，隨著脫色速率的提高，總糖保留率持續(xù)上升，而脫色率和脫蛋白率逐漸下降.為確?？偺潜Ａ袈?、脫色率和脫蛋白率，綜上因素，選擇甘薯硒多糖的洗脫速率為4.5 mL/min.

圖5 吸附平衡時(shí)間的影響

圖6 洗脫速率的影響

3 討論

綜上研究，選擇上樣量為600 mg、上樣體積為60 mL(2/5倍柱體積)、吸附平衡時(shí)間為20 min、洗脫速率為4.5 mL/min為本實(shí)驗(yàn)的工藝參數(shù)時(shí)，其脫色率為85.5%、脫蛋白率76.2%、總糖保留率68.2%.由于硒多糖的生物活性可決定其抗氧化和抗腫瘤的活性[7]，因此最大程度的保護(hù)甘薯硒多糖活性不被破壞并綠色環(huán)保，是聚酰胺柱層析法脫蛋白工藝研究的目的所在.